銳孔法制備水牛乳活性肽微膠囊工藝優化及體外釋放研究

袁靖琳,陳 燏,韋翠蘭,蘇海燕,梁曉琳,蔡 達,李全陽,*

(1.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004;2.華南理工大不食品科學與工程學院，廣西南寧 530004;3.廣西東盟食品藥品安全檢驗檢測中心,廣東廣州 510006)

銳孔法制備水牛乳活性肽微膠囊工藝優化及體外釋放研究

袁靖琳1,陳 燏1,韋翠蘭2,蘇海燕3,梁曉琳1,蔡 達1,李全陽1,*

(1.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004;
2.華南理工大不食品科學與工程學院，廣西南寧 530004;
3.廣西東盟食品藥品安全檢驗檢測中心,廣東廣州 510006)

為了減少胃腸道對抗氧化活性肽的分解并使其具有腸道緩釋效果,以海藻酸鈉、殼聚糖為壁材,用銳孔法制備水牛乳活性肽微膠囊。通過響應面法優化了海藻酸鈉溶液濃度、殼聚糖溶液濃度以及Ca2+濃度的工藝條件,并對制備的微膠囊進行掃描電鏡觀察以及體外釋放檢測。結果表明:制備載水牛乳活性肽微膠囊的優化工藝為：海藻酸鈉、殼聚糖和CaCl2溶液的濃度分別為1.28%、1.51%和2.20%(w/v),在此工藝條件下,活性肽的包埋率可達95.20%。通過掃描電鏡發現,海藻酸鈉-殼聚糖復合壁材載肽結構完整緊實。體外緩釋實驗表明,樣品在人工胃液(pH=2.0)中釋放量為7.98%,在人工腸液(pH=6.8)中作用12 h后的相對累計釋放量為89.41%,樣品表現出耐酸和良好的模擬腸道環境緩釋效果,制備的水牛乳活性肽微膠囊能夠較好的保護目標肽、提高穩定性、耐酸和緩釋效果。

水牛乳活性肽,銳孔法,微膠囊,體外釋放

黑白花奶牛的牛乳蛋白中包含許多具有生物學活性的肽段[1]。本實驗室前期研究的水牛乳蛋白水解物中也含有很多的活性肽,尤其是抗氧化活性肽。閉秋華用中性蛋白酶分別酶解水牛乳酪蛋白和乳清蛋白,超濾分離得到了多組具有抗氧化性的多肽[2];此外,Shanmugam[3]等人用胃蛋白酶酶解水牛乳酪蛋白,分離得到了11段具有抗氧活性的小肽;李玲[4]等人用堿性蛋白酶酶解酪蛋白得到一種肽粉,并用這種肽粉灌胃D-半乳糖致衰老小鼠,一定程度上提高了衰老小鼠的抗氧化能力。這些研究表明水牛乳乳源抗氧化肽具有良好的開發應用價值,然而抗氧化肽不穩定,易受環境影響而變質,口服時則易受消化道逆環境影響失去原有的功能性,這些因素在很大程度上阻礙了乳源抗氧化肽的市場推廣的進程。因此,通過一定的工藝手段提高食源活性肽的穩定性及其生物利用率則成了一個亟待解決的問題。

張路[5]用銳孔法以海藻酸鈉、氯化鈣以及其他輔料制備了包埋率為61.35%的載玉米多肽微膠囊;張生生等[6]用銳孔凝固浴法制備以海藻酸鈉、氯化鈣制備了包埋率為87.6%的載抗菌脂肽微膠囊,該微膠囊具有較好的腸液緩釋效果。在這些研究的基礎上,本研究選擇了以天然、無毒、生物相容性較好并具有抗菌性的大分子材料殼聚糖,與海藻酸鈉共為復合壁材,氯化鈣為凝固劑,采用無需有機溶劑、無需高速攪拌、設備簡單易操作且對芯材影響較小的銳孔法[7-8]制備水牛乳抗氧化肽微膠囊。以這兩種材料為復合壁材包埋目標物的相關研究主要集中于藥物控釋緩釋等領域,從而達到緩釋和提高生物利用率的目的,如制備具有緩釋作用的載胰島素微球[9-11]、載疫苗微球[12]以及抗癌藥物微球[13]等,但在食品工業領域相關研究較少，且鮮見以這種復合壁材包埋水牛乳多肽的相關報道。本研究旨在探索一種新的載水牛乳多肽微膠囊制備工藝條件,以期為制備具有緩釋作用的活性肽食品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖、海藻酸鈉 上海源葉生物科技有限公司;氯化鈣 天津科密歐試劑有限公司;冰醋酸、乙醇、85%磷酸 成都科龍試劑有限公司;胃蛋白酶(Potency=1∶3000)、胰蛋白酶(Potency>1∶250)、中性蛋白酶(酶活不低于60000 活力單位/g) 南京都萊生物技術有限公司。

UV5200型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;HL-2D定時數顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司;VORTEX-5漩渦震蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;SHZ-82氣浴恒溫振蕩器 上海皓莊儀器有限公司;Phenom臺式掃描電鏡 Phenom-World公司;SBC-12離子濺射儀 中科科儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 水牛乳活性肽制備 參照參考文獻方法[2,14],使用中性蛋白酶酶解水牛乳全蛋白進行制備,樣品經冷凍干燥、真空封裝,于-20 ℃環境中存放。

1.2.2 水牛乳活性肽微膠囊制備

1.2.2.1 微膠囊制備工藝 配制海藻酸鈉溶液(壁材A)、1%醋酸-殼聚糖溶液(壁材B),過夜溶脹,靜置。凝固液為相應濃度的CaCl2溶液(C液)。精稱1.00 g凍干多肽粉均勻分散于50 mL壁材A中,同時將50 mL壁材B與50 mL凝固液C混合均勻作為凝固浴液。多肽-壁材A混合物通過恒流泵勻速泵入凝固浴液中,出口段有銳孔(Φ=0.45 mm)固化造粒,期間不斷攪拌,直至顆粒完成固化，過濾獲得膠粒微球并保留濾液。蒸餾水清洗微球表面除去表面殘留的多肽,用濾紙吸干表面水分,即得載肽濕微球。-80 ℃預凍,經真空冷凍干燥,獲得載肽干微球,用于電鏡掃描觀察。將壁材A直接滴入凝固浴中制備空白微球,其余步驟同上。

1.2.2.2 包埋率及載肽量計算 用考馬斯亮藍法。取1.2.2.1中制載肽濕微球濾液1 mL與5 mL考馬斯亮藍溶液混合均勻,在5 min內于595 nm處測定吸光值得Ai。同樣取制空白濕微球濾液1 mL進行檢測得A0,1.000 g多肽與100 mL凝固浴液充分混勻,取1 mL混合液用考馬斯亮藍法測吸光值得Aj;同時測定空白凝固浴的吸光值得Ac。用相對載肽率表示包埋率，計算公式如下:

式(1)

式中:Ai-載肽微球制備殘液吸光值;A0-空白微球制備殘液吸光值;Aj-1 g多肽-凝固浴吸光值;Ac-凝固浴吸光值。

式(2)

1.2.2.3 單因素實驗 經預實驗后確定海藻酸鈉、殼聚糖以及CaCl2溶液的濃度(w/v)為需優化因素。造粒方法同上。分別考察:

當殼聚糖溶液濃度為1.50%,CaCl2溶液的濃度為2.00%時,海藻酸鈉添加量(0.50%、0.75%、1.0%、1.25%、1.50%)對包埋率的影響;

當海藻酸鈉溶液濃度為1.25%,CaCl2溶液的濃度為2.00%時，殼聚糖添加量(0、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%)對包埋率的影響;

當海藻酸鈉溶液濃度為1.25%,殼聚糖溶液的濃度為1.50%時,CaCl2溶液的濃度(1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%)對包埋率的影響。

1.2.2.4 Box-Benhnken響應面優化實驗 經單因素實驗后確定因素優化水平范圍,設計三因素三水平響應面優化實驗(見表1),并對實驗結果進行驗證。

表1 實驗設計因素及水平表Table 1 Factors and levels table of the experimental

1.2.3 水牛乳活性肽微膠囊特性表征

1.2.3.1 微膠囊掃描電鏡(SEM)分析 按優化后的最佳工藝分別制備復合壁材載肽微球(Alg-CS-肽)和相應空白微球。并按最佳工藝海藻酸鈉濃度制備海藻酸鈉單一壁材載肽微球(Alg-肽)和相應空白微球。微球經冷凍干燥,用導電膠固定在樣品臺上,噴金后,用掃描電鏡進行觀察。同時進行光學顯微鏡觀察,放大倍數為40倍。

1.2.3.2 微膠囊于人工胃腸液中緩釋情況分析 參照《中國藥典》(2010版)配制人工胃液及人工腸液[15]。

參照1.2.3.1的方法按最佳工藝制備空白微球(B-Alg-CS-MC)及載肽微球(B-Alg-CS-PP-MC)，并按最佳工藝海藻酸鈉濃度制備單一壁材空白微球(B-Alg-MC)及相應載肽微球(B-Alg-PP-MC)。

模擬消化累計釋放曲線,參照張杰[16]的方法稍作修改:分別取1.00 g載肽微球(PP-MC)和相應空白微球(MC),并按載肽量換算出相應肽量(PP)。將PP-MC、MC及PP均置于100 mL人工胃液中消化。消化條件為:37 ℃,100 r/min。分別在0、0.5、1、2 h各取2 mL液體,4000 r/min,離心5 min,取1 mL上清液,按1.2.2.2方法測吸光值。每次取液后用空白人工胃液補足至100 mL。按式(3)計算相對釋放量。將經過2 h模擬胃液消化的微球過濾,用蒸餾水洗凈附著的胃酶和肽并吸干水分,放入100 mL模擬腸液中。消化釋放量測定和計算同上。分別計算0、1、2、4、6、8、10、12 h的相對釋放量。

式(3)

式中:Ai-載肽微球相應時間模擬胃/腸液上清液吸光值；Aj-空白微球相應時間模擬胃/腸液上清液吸光值；At-對應載肽量肽相應時間模擬胃/腸液上清液吸光值；A0-相應時間空白模擬胃/腸液上清液吸光值。

以消化時間為橫坐標,累計相對釋放量為縱坐標,制作載肽微球釋放曲線。所有測量平行三次。

1.3 數據處理

分別用SPSS 19.0和Design-Expert 8.0.6進行相應數據分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 海藻酸鈉溶液濃度對包埋率的影響 海藻酸鈉溶液濃度對包埋率的影響實驗結果見圖1。

圖1 海藻酸鈉溶液濃度對包埋率的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on peptides loading efficacy

由圖1可知,包埋率隨海藻酸鈉溶液濃度的增加呈先增加后減少的趨勢。在0.50%～0.75%的范圍內時,微膠囊包埋率變化不大;在0.75%～1.25%的范圍內時,包埋率逐漸上升;在1.25%～1.50%的范圍內時,包埋率則逐漸下降,當海藻酸鈉溶液濃度為1.25%時包埋率達到最大值。低濃度海藻酸鈉微球性狀不規則,過濾時容易破裂,降低了包埋率;而當海藻酸鈉的濃度超過1.50%時,肽粉只能均勻分散其中,但是高濃度的海藻酸鈉難以通過銳孔,形成的顆粒有嚴重的拖尾現象,使得包埋率降低。因此,在本實驗中,最適的海藻酸鈉溶液濃度在1.25%左右。

2.1.2 殼聚糖溶液濃度對包埋率的影響 殼聚糖溶液濃度對包埋率的影響實驗結果見圖2。

圖2 殼聚糖溶液濃度對包埋率的影響Fig.2 Effect of chitosan concentration on peptides loading efficacy

由圖2可知,微膠囊的包埋率隨殼聚糖溶液濃度增加呈先增大后減小的趨勢。當殼聚糖溶液濃度為1.50%時,包埋率最大。殼聚糖濃度適當增加可以提高包埋率,而濃度過高時使得微球軟塌易破裂,導致微膠囊包埋率降低。Anjani K等[17]報道,殼聚糖與海藻酸鈉的結合減少了正乙酰化程度,可有效減小海藻酸鈉-鈣網狀結構的縫隙；張志辰等[18]則報道,殼聚糖濃度過高時會降低海藻酸鈣膜的機械強度,這一結果是在殼聚糖的伯胺基與海藻酸鹽分子鏈上的羧基結合完畢后,多余的帶電殼聚糖分子影響海藻酸鈣膜造成的。因而,在本實驗中,最適的殼聚糖溶液濃度在1.50%左右。

2.1.3 CaCl2溶液濃度對包埋率的影響 CaCl2溶液濃度對包埋率的影響實驗結果見圖3。

圖3 CaCl2溶液濃度對包埋率的影響Fig.3 Effect of calcium chloride concentration on peptides loading efficacy

由圖3可知,微膠囊的包埋率隨著CaCl2溶液濃度增加呈先增大后減少的趨勢。當CaCl2溶液濃度在1.00%～2.00%時,包埋率隨著CaCl2溶液濃度的增加而增加;而當CaCl2溶液濃度大于2.00%之后,包埋率隨CaCl2溶液濃度濃度增加而減小。當CaCl2溶液濃度在2.00%時,微膠囊的包埋率達到最大值。鈣離子的濃度較低時包埋率較低,此時海藻酸鈉除了交聯作用外,剩余的陰離子海藻酸多糖通過靜電作用與陽離子殼聚糖相互作用,此時形成的膜較薄,容易破裂;而當鈣離子濃度高于最適濃度后包埋率呈降低趨勢,海藻酸鈉進入高度濃度鈣離子凝固浴迅速形成致密的凝膠膠束,這一結構減少了殼聚糖與海藻酸鈉的結合,使得海藻酸-鈣膜的縫隙較多,也會降低包埋率,Gaserod等[19]早期也報道過鈣離子與殼聚糖競爭結合海藻酸鈉,以及過多的鈣離子會減少海藻酸鈉與殼聚糖的靜電結合作用。因此,在本實驗中,最適CaCl2溶液濃度在2.0%左右。

表3 響應面回歸方程方差分析Table 3 ANOVA for the response surface quadratic model

注:“*”表示顯著(p<0.05),“-”表示不顯著。

2.2 響應面優化實驗

在單因素實驗的基礎上，以包埋率為響應值,對海藻酸鈉溶液濃度、殼聚糖溶液濃度以及CaCl2溶液濃度進行三因素三水平響應面優化,得到表2的實驗結果。

表2 響應面設計方案及實驗結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

對該實驗結果進行回歸模型建立以及相關回歸方程方差分析,分析結果見表3。得到以響應值Y包埋率(%),A:海藻酸鈉、B:殼聚糖、C:CaCl2建立的二次回歸方程:

Y=-160.382+298.805A-1.856B+59.0495C+44.26AB-13.8AC-5.97BC-130.712A2-14.348B2-7.378C2

從表3結果來看,一次項A(海藻酸鈉)、B(殼聚糖)及C(CaCl2)均對包埋率有顯著影響(p<0.05),其中A>C>B,A(海藻酸鈉)對包埋率影響顯著;二次交互項AB、AC、BC均對包埋率有顯著影響,且AB>AC>BC。

進一步分析交互作用,由響應曲面圖及等高線可知,AB、AC及BC的等高線均呈橢圓形,表明該三項因素兩兩交互作用明顯。其中AB的變化較另外兩項快,進一步說明AB項對包埋率的影響較其它兩項更為明顯。

圖4 各項實驗因素交互作用Fig.4 Interaction of experimental factors conditions on peptides loading efficacy

對所求的二次方程求導,得到A=1.28%、B=1.51%、C=2.20%。即最優工藝組合為:海藻酸鈉溶液濃度為1.28%,殼聚糖溶液濃度為1.51%,CaCl2溶液濃度為2.20%。對該工藝參數進行驗證實驗,得到包埋率為95.20%±0.13%,在誤差允許范圍內略高于預測值93.50%(RSD=1.27%),表明該模型準確可信。同時還以最佳工藝制備了單一海藻酸鈉-CaCl2載肽微膠囊,測得其包埋率為85.32%±0.50%,比復合壁材的包埋率低10%左右。這一實驗結果與單因素實驗結果相吻合,亦說明復合壁材的選擇是合理且有意義的。

2.3 電鏡掃描

為了直觀反映微膠囊制備效果,分別采用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡對樣品進行觀察,具體見圖5、圖6。

圖5 兩種微膠囊光學顯微鏡觀察圖(40×)Fig.5 Optical microscopy images of Alg microcapsules and Alg/CS microcapsules(40×)注:a:單一壁材海藻酸鈉空白微膠囊; b:復合壁材海藻酸鈉-殼聚糖空白微膠囊; c:單一壁材海藻酸鈉載肽微膠囊; d:復合壁材海藻酸-殼聚糖載肽微膠囊;圖6同。

圖6 兩種微膠囊掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy images of Alg microcapsules and Alg/CS microcapsules注：a:265×,b:245×,c:265×,d:290×。

經冷凍干燥后,整體觀察對比觀察。由圖5可知單一壁材海藻酸鈉制備的微球表面凹凸粗糙,結構松散,孔隙較大,而復合壁材海藻酸鈉-殼聚糖制備的微球表面平滑,結構密實均一;由圖6可知,復合壁材海藻酸鈉-殼聚糖制備的微球幾乎無空隙,且微囊壁較厚無裂紋。殼聚糖的酰基基團修飾作用使得復合壁材微膠囊囊壁光滑,同時這種作用力使得鈣離子和海藻酸鈉羧酸根粒子基團之間形成空間位阻,增加了疏水性,在這兩種作用力的共同作用下,復合壁材微膠囊的結構致密均勻。Estevinho等[20]也報道,在制備VB12和VC微膠囊時,海藻酸鈉的存在使得以殼聚糖為壁材的微球形態規則且表面更為光滑,內容物更穩定。實驗結果說明,由復合壁材組成的微囊結構比單一壁材的結構更為穩定,能夠更好地保護目標抗氧化肽。

2.4 體外釋放實驗

單一壁材海藻酸鈉-CaCl2載肽微膠囊和復合壁材海藻酸鈉-殼聚糖-CaCl2載肽微膠囊在人工胃腸液中連續釋放情況的檢測結果見圖7。

圖7 載肽微膠囊在模擬胃腸液中連續釋放曲線Fig.7 Release profile of peptide microcapsules in SGF and SIF

由圖7可知,單一壁材載肽微膠囊經模擬胃液(pH=2.0)消化作用2 h后,累計釋放了57.08%的多肽,且這一過程相當快,而復合壁材微膠囊經2 h的模擬胃液消化后,僅釋放了7.89%,緩慢釋放;進入模擬腸液(pH=6.8)后,單一壁材載肽微膠囊釋放速率減緩,4 h后釋放趨于平穩,經12 h的模擬腸液消化后,累計釋放量為86.96%。與單一壁材不同的是,復合壁材載肽微膠囊進入模擬腸液后,1 h時累計釋放量為32.05%,迅速釋放,是2 h模擬胃液累積釋放量的4倍,10 h后,釋放趨于平穩,經模擬腸液消化作用12 h后,累積釋放量達到89.41%。實驗結果表明,以海藻酸鈉和殼聚糖為復合壁材包埋水牛乳抗氧化肽可以較好地抵抗模擬胃液的消化,而在較為溫和的模擬腸液中則能緩慢釋放。Mukhopadhyay P等[9]報道經殼聚糖-海藻酸鈉包埋的胰島素對環境pH敏感,在酸性條件下幾乎不釋放,在中性環境中可以緩慢釋放,經過復合壁材包埋的胰島素經口服可以有效延長胰島素在糖尿病模型小鼠體內降血糖的時間;李瑞偉等[12]用海藻酸鈉-殼聚糖制備的草魚出血病細胞疫苗在pH2.3的鹽酸溶液處理3 h累計釋放量僅為15.57%,而在pH7.4的PBS中3 h釋放量為30%,且在14 d后才基本釋放完全,較好地達到了讓疫苗緩慢釋放的用藥需求。綜合分析可知，以殼聚糖-海藻酸鈉為復合壁材制備的載水牛乳活性肽微膠囊也具備在體內緩釋從而提高該活性肽生物利用率的潛能。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，經響應面優化得到銳孔法制備載水牛乳多肽微膠囊最佳工藝組合:海藻酸鈉溶液濃度1.28%,殼聚糖溶液濃度1.51%,CaCl2溶液濃度2.20%，包埋率為95.20%。掃描電鏡觀察發現這種復合壁材載肽微膠囊結構緊密均勻。在模擬體外消化實驗中,經人工胃液消化2 h,累計釋放量僅為7.89%,經腸液消化12 h后,釋放量為89.41%,表現出耐酸和緩釋功能,對比分析認為該技術較好地達到了讓抗氧化活性肽在腸道環境內緩釋并發揮作用的目的，所需壁材配制的濃度相對較低,有利于工業化推廣。該項技術為生產高利用價值的水牛乳活性肽產品提供了一種新方法,也將為相關食品功能性成分的產業化提供了一項新的技術手段。

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Optimization of preparation process of buffalo milk active peptides microspheres by piercing method andinvitroreleasing behavior of the microcapsules

YUAN Jing-lin1,CHEN Yu1,WEI Cui-lan2,SU Hai-yan3,LIANG Xiao-lin1,CAI Da1,LI Quan-yang1,*

(1.College of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China; 2.Guangxi ASEAN Food and Drug Safety Inspection and Testing Center,Nanning 530004,China; 3.School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China)

In order to reduce the decomposition of the antioxidant peptide in the gastrointestinal tract and to have a sustained release behavior,encapsulated buffalo milk antioxidant peptides were prepared by piercing method using sodium alginate and chitosan as the shell. Based on peptides loading efficacy,and determined by one-factor experimental results,operating parameters as sodium alginate concentration,chitosan concentration and calcium chloride concentration were optimized by response surface methodology. The prepared microspheres were subjected by scanning electron microscopy and researched on itsinvitroreleasing behavior. The results showed that the optimal operating parameters were 1.28%,1.51%,and 2.20%(w/v)for sodium alginate concentration,chitosan concentration and calcium chloride,respectively. Upon the optimal conditions,the experiment led to an encapsulated efficacy of 95.20%. Scanning electron microscopy showed that the alginate-chitosan microcapsules had compact structure. Theinvitrorelease studies showed that the release rate was only 7.98% in the simulated gastric buffer(pH=2.0),and 89.41% in simulated intestinal buffer(pH=6.8). It showed that the sample had an acid-resistant and good slow-release behavior in simulated intestinal buffer. These results conclusively suggested that encapsulated buffalo mike antioxidant peptides by this process can protect the peptides,and improve its stability,acid resistance and sustained release behavior.

buffalo milk antioxidant peptides;piercing method;microcapsules;invitrorelease

2016-10-11

袁靖琳(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：功能性食品加工原理與工藝，E-mai:c535317194@163.com。

*通訊作者:李全陽(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養與健康長壽，E-mail:liquanyang@gxu.edu.cn。

國家自然科學基金面上項目資助(31371762)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)08-0227-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.036