超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖

陳 超,岳崇慧,王艷菲,藏小丹,劉 鵬,于國萍

(東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖

陳 超,岳崇慧,王艷菲,藏小丹,劉 鵬,于國萍*

(東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

目的:為了研究榛蘑中多糖的提取條件,以榛蘑多糖得率為指標,采用超聲波輔助復合酶(纖維素酶、木瓜蛋白酶)法進行實驗。方法:通過單因素實驗研究了酶解溫度、超聲功率、超聲時間、液料比、酶解時間、復合酶比例以及加酶量對榛蘑多糖得率的影響,在此基礎上進行響應面優化實驗。結果:通過單因素實驗,確定了酶解溫度50 ℃、超聲功率360 W、超聲時間20 min;通過響應面優化實驗,確定了最佳提取條件:加酶量1.9%、復合酶比例2∶1、酶解時間138 min、液料比30∶1(mL/g)。結論:在此條件下,榛蘑多糖得率為40.56%。

榛蘑,多糖,超聲波,纖維素酶,木瓜蛋白酶

榛蘑又名蜜環菌,隸屬于真菌界,是口蘑科真菌蜜環菌的子實體,普遍存在于溫帶地區。榛蘑口感鮮美,富含豐富的營養物質,如蛋白質、碳水化合物、維生素、以及鋅、鐵、鎂等礦物質,因此可以開發具有功能性的榛蘑食品[1]。

榛蘑多糖作為一種活性多糖,具有促進造血、免疫調節、抑制腫瘤生長等藥理作用[2]。近年來,藥用真菌多糖因其具有降血脂、抗感染等功能,逐漸引起了人們的關注。關于榛蘑多糖的研究早已有所報道,余晨晨等[3]利用紅外光譜、氣相衍生化分析榛蘑水溶性多糖的結構,實驗結果表明,榛蘑多糖結構由吡喃葡萄糖組成;也有研究發現[4],榛蘑子實體胞內多糖由D-葡萄糖和D-半乳糖組成,氣相色譜分析結果顯示,二者比例為5∶1。榛蘑多糖的提取方法有很多[5],如采用熱水、稀酸、稀堿作為浸提劑,但這些方法操作時間長、效率低,多糖提取率普遍不高。而超聲波法提取多糖,是利用超聲波產生的振動破壞細胞壁,使溶劑滲透到細胞中,能使物質中分子加速運動,從而提高提取率[6];酶可以水解纖維素、糖蛋白,以及酶具有高效性和專一性,使得在提取過程中能夠節約時間、產物穩定[7]。

本實驗采用超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖,具有提取時間短、效率高等特點,優化榛蘑多糖的提取工藝,對榛蘑多糖的工業化生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榛蘑 產自黑龍江省尚志市珍珠山鄉,清水洗凈后放入干燥器進行干燥,之后用粉碎機粉碎,過60目篩,備用;葡萄糖、苯酚、濃硫酸等 均為分析純;纖維素酶 315000 U/g,上海藍季技術發展有限公司;木瓜蛋白酶 490200 U/g,北京奧博星生物技術有限責任公司。

表1 響應面因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design

DZW電熱恒溫水浴鍋 天津萊斯特儀器有限公司;PHSJ-3F實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;H-1微型漩渦混合器 上海精科實業有限公司;AL-104型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司;TU-1800紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;小型臺式高速離心機 上海安亭科學儀器廠;FW型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 榛蘑多糖提取得率測定

1.2.1.1 葡萄糖標準曲線的繪制 分別向8支試管中吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL的100 μg/mL的葡萄糖溶液,用蒸餾水將每支試管補至2.0 mL。隨后向每支試管中分別加入1.0 mL濃度為6%的苯酚,迅速滴加濃硫酸5.0 mL,振蕩均勻后于沸水浴中煮沸20 min,冷卻5 min,并在490 nm處測定吸光度[8]。以葡萄糖濃度為橫坐標x,吸光度為縱坐標y,繪制葡萄糖標準曲線得y=0.007x-0.006,R2=0.999。

1.2.1.2 多糖提取得率的計算 移取2.0 mL多糖提取液,按照與制作標準曲線相同的方法測定吸光度,以2.0 mL蒸餾水按相同操作作為空白實驗。

榛蘑多糖得率(%)=多糖濃度(g/mL)×稀釋倍數×提取液體積(mL)/原料質量(g)×100

1.2.2 超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖的工藝 稱取粒徑為60目的榛蘑樣品5 g,首先按照不同的條件在水溶液中酶解。隨后100 ℃沸水中滅酶10 min,冷卻至室溫。接著上述體系再經過不同條件的超聲處理后,于4000 r/min離心30 min,所得到的上清液即為榛蘑多糖提取液。將上清液稀釋適當倍數后,依照葡萄糖標準曲線的制作方法,在490 nm波長處測定吸光度值。

1.2.3 超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖的單因素實驗 研究液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)、酶解時間(80、100、120、140、160 min)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)、加酶量(占底物的百分比，1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%)、復合酶比例(纖維素酶∶木瓜蛋白酶為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)、超聲功率(240、280、320、360、400 W)和超聲時間(10、15、20、25、30 min)7個因素對多糖得率的影響。其中,固定值為:液料比20∶1、酶解時間2 h、酶解溫度45 ℃、加酶量(占底物百分比)1%、復合酶比例為1∶1、超聲功率320 W、超聲時間20 min。

1.2.4 響應面法對榛蘑多糖提取條件進行優化 在單因素實驗的基礎上,根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理,采用響應面法在四因素三水平上對多糖提取條件進行優化。如表1所示。

1.3 數據處理

數據使用統計分析軟件Design-Expert.V8.0.6.1進行實驗設計和數據分析;使用SPSS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖的條件確定

2.1.1 液料比對多糖得率的影響 如圖1所示,多糖得率會隨著液料比的增加而增大,這是由于液料比的增加,使得更多的水分子滲透到物料中,從而增大了多糖與水分子的接觸面積[9],利于多糖的提取;當液料比超過20∶1時,隨著體系中水分的增加使酶濃度降低,酶與底物結合不充分,就出現了提取得率下降的趨勢[10];而且液料比過高不利于后期的分離濃縮,因此選擇20∶1作為多糖的最佳液料比。

圖1 液料比對多糖得率的影響Fig.1 The effect of liquid material ratio on the rate of polysaccharide extraction注:不同字母代表差異顯著(p<0.05),圖2～圖7同。

2.1.2 酶解時間對多糖得率的影響 如圖2所示,多糖提取得率會隨著酶解時間的增加而增大,這是由于酶解時間過短,多糖在水溶液中溶解不徹底;當酶解時間140 min時,溶劑的滲透與多糖向周圍溶劑的擴散達到平衡,此時多糖得率達到最大值;當超過140 min時,提取得率有下降趨勢,可能的原因是提取時間過長會引起多糖水解[10]。因此選擇140 min作為提取的最佳酶解時間。

圖2 酶解時間對多糖得率的影響Fig.2 The effect of enzymolysis time on the rate of polysaccharide extraction

2.1.3 酶解溫度對多糖得率的影響 本實驗選用的復合酶為纖維素酶和木瓜蛋白酶,其中纖維素酶的最適溫度范圍是40～60 ℃,而木瓜蛋白酶的最適溫度范圍是50～65 ℃[8]。如圖3所示,多糖得率會隨著酶解溫度的升高而增大;當溫度超過50 ℃,多糖得率會顯著下降,是由于溫度的升高導致酶活性降低或使部分酶失活[7]。而50 ℃是兩種酶都適合的反應溫度,因此選擇50 ℃作為提取多糖的最佳酶解溫度。

圖3 酶解溫度對多糖得率的影響Fig.3 The effect of enzymolysis temperature on the rate of polysaccharide extraction

2.1.4 加酶量對多糖得率的影響 如圖4所示,多糖得率會隨著加酶量的增加而增大,當加酶量超過1.75%時,多糖得率下降,其原因可能是當酶濃度達到一定程度時,酶分子處于過度飽和狀態,導致一部分酶無法與底物結合,使提取得率降低[11]。因此選擇1.75%作為提取多糖的最佳加酶量。

圖4 加酶量對多糖得率的影響Fig.4 The effect of enzyme concentration on the rate of polysaccharide extraction

2.1.5 復合酶比例對多糖得率的影響 如圖5所示,當復合酶比例從3∶1變為2∶1時,多糖得率增大,其原因可能是:這兩種酶在此比例時,對蛋白、纖維素兩類物質的分解達到最大值,在分解細胞結構的同時有利于多糖的浸出;當復合酶的比例從2∶1逐漸變為1∶3時,兩種酶的比例與相應底物的比例不符,分解的量少,多糖得率降低;此外,當復合酶中木瓜蛋白酶的比例增大時,可能是由于木瓜蛋白酶在分解蛋白類物質的同時,產生的小分子物質對多糖有一定的包埋作用[7],從而影響多糖的提取。所以只有在復合酶比例為2∶1時,這兩種酶都能充分發揮作用。因此選擇2∶1作為提取多糖的最佳復合酶比例。

圖5 加酶比例對多糖得率的影響Fig.5 The effect of ratio of compound enzyme on the rate of polysaccharide extraction

2.1.6 超聲功率對多糖得率的影響 如圖6所示,得率會隨著超聲功率的增加而增大,其原因可能是超聲功率增大,超聲的空化作用和攪拌作用增強,超聲的空化作用會破壞溶質的細胞壁,使得溶劑更易進入細胞中,從而使多糖得率增大;然而若超聲功率超過360 W,超聲波的劇烈作用會對多糖產生破壞作用從而降低得率[12]。因此選擇360 W作為提取多糖的最佳超聲功率。

圖6 超聲功率對多糖得率的影響Fig.6 The effect of ultrasonic power on the rate of polysaccharide extraction

圖7 超聲時間對多糖得率的影響Fig.7 The effect of ultrasonic time on the rate of polysaccharide extraction

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Rseponse surface design arrangement and experimental results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

注:**:影響極顯著(p<0.01);*:影響顯著(p<0.05)。

2.1.7 超聲時間對多糖得率的影響 如圖7所示,多糖得率會隨著超聲時間的增加而增大;當超聲時間超過20 min,多糖得率反而下降。其原因可能是超聲時間的增加使得提取溶劑有充足的時間和榛蘑粉末作用,有利于多糖的溶出;若超聲時間過長,溫度和超聲波會對已經提取出的多糖產生破壞作用,降低得率[13]。因此選擇20 min作為提取多糖的最佳超聲時間。

2.2 響應面優化實驗結果

2.2.1 模型的建立及顯著性的檢驗 采用響應面分析法分析實驗結果,結果見表2,得到以榛蘑多糖得率為響應值的回歸方程:

Y=40.81+3.75A+3.05B-0.12C-0.30D-2.61AB-2.24AC-0.96AD-0.90BC+4.52BD+2.39CD-4.37A2-6.92B2-5.17C2-5.76D2。

為了檢驗回歸方程的有效性及各因素對榛蘑多糖得率的影響程度,對回歸方程進行方差分析,結果見表3。從表3可以看出,回歸模型中,p<0.0001,表明得到的回歸方程擬合程度較好,回歸效果極顯著;而失擬項p=0.5142>0.05,說明失擬項不顯著。因此,應用此方程來模擬指標值與因素的關系是可行的。同時,其方程的相關系數R2=0.9767,表明97.67%的數據可以用此方程解釋。

由表3還可知,加酶量A和復合酶比例B的p<0.01,說明對多糖得率影響差異極顯著,酶解時間C和液料比D的p>0.05,說明對多糖得率影響差異不顯著;四個因素的二次項對榛蘑多糖得率的影響均達到差異極顯著水平;而交互項AB、AC、BD、CD對多糖得率的影響差異極顯著,AD、BC對多糖得率的影響差異不顯著。

2.2.2 響應面交互作用的分析與優化 通過Design-Expert軟件繪制響應面曲線圖,目的是進一步研究各因素之間的交互作用。圖8～圖13分別顯示了6組以榛蘑多糖得率為響應值的趨勢圖。

圖8 加酶量和復合酶比例對多糖得率的響應面Fig.8 Curved surface of response of enzyme concentration and ratio of compound enzyme to the rate of polysaccharide extraction

圖9 加酶量和酶解時間對多糖得率的響應面Fig.9 Curved surface of response of enzyme concentration and enzymolysis time to the rate of polysaccharide extraction

從圖8可知,加酶量和復合酶比例的交互作用對多糖得率的影響較大。隨著加酶量和復合酶比例的增加,多糖得率均呈現先升高后下降趨勢。這主要是由于,當反應體系中酶濃度增大時,酶與底物的接觸機會增加,多糖溶出加快;反之,由于溶液中的酶分子已經飽和,多余酶分子無法與底物結合,底物水解的速度就會減慢,使得多糖得率下降[5],因此只有在適宜的加酶量和復合酶比例條件下,多糖得率才能達到最大值。

同樣,從圖9～圖13中可以看出,加酶量和酶解時間、復合酶比例和液料比、酶解時間和液料比的交互作用，對多糖得率影響極顯著。只有加酶量和酶解時間、加酶量和液料比、復合酶比例和酶解時間、復合酶比例和液料比、酶解時間和液料比的比例適合，多糖得率才能達到最大值。

圖10 加酶量和液料比對多糖得率的響應面Fig.10 Curved surface of response of enzyme concentration and liquid material ratio to the rate of polysaccharide extraction

圖11 酶解時間和復合酶比例對多糖得率的響應面Fig.11 Curved surface of response of enzymolysis time and ratio of compound enzyme to the rate of polysaccharide extraction

圖12 液料比和復合酶比例對多糖得率的響應面Fig.12 Curved surface of response of liquid material ratio and ratio of compound enzyme to the rate of polysaccharide extraction

由各響應面可以看出,響應值存在最大值。通過軟件分析計算得出多糖的理論最佳提取工藝:加酶量1.86%、復合酶比例2.14∶1、酶解時間137.55 min、液料比29.69∶1 mL/g,在此條件下,多糖得率為41.83%。為了驗證該模型的準確性,采用修正的最佳提取條件:加酶量1.9%、復合酶比例2∶1、酶解時間138 min、液料比30∶1 mL/g,對多糖得率進行驗證性實驗,平行實驗3次,多糖得率的平均值為40.56%,與理論預測值(41.83%)的相對標準偏差RSD為1.08%,說明該回歸模型準確可靠。由于榛蘑多糖的提取工藝不同,得到的多糖得率也不盡相同。鄒東恢[5]、邵信儒[1]分別采用多酶法和熱水浸提法從榛蘑中提取多糖,得率分別為16.85%和4.81%。相比之下,本實驗采用的超聲波輔助復合酶法得到的多糖得率更高,對榛蘑多糖的工業化生產具有重要意義。

3 結論

在超聲波輔助酶法提取榛蘑多糖的實驗中,通過單因素實驗確定酶解溫度50 ℃、超聲波功率360 W、超聲波時間20 min;在此基礎上,通過響應面優化實驗得到最佳工藝條件為:加酶量1.9%、復合酶比例2∶1、

圖13 酶解時間和液料比對多糖得率的響應面Fig.13 Curved surface of response of enzymolysis time and liquid material ratio to the rate of polysaccharide extraction

酶解時間138 min、液料比30∶1(mL/g),此條件下得到的最佳提取得率為40.56%,與理論預測值基本相符,因此可以用該模型分析響應值的變化。

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Ultrasonic-assisted enzymatic method extraction of polysaccharide fromArmillariamellea

CHEN Chao,YUE Chong-hui,WANG Yan-fei,ZANG Xiao-dan,LIU Peng,YU Guo-ping*

(College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Objective:In order to study the extraction technology of polysaccharide fromArmillariamellea,based on the polysaccharide yield,polysaccharide was extracted by ultrasonic-assisted enzymatic(cellulase,papain)method. Method:This paper studied the optimal extraction conditions by single factor experiment,such as enzymolysis temperature,ultrasonic power,ultrasonic time,liquid material ratio,enzymolysis time,ratio of compound enzyme,enzyme concentration. The optimal conditions were obtained by response surface methodology on the basis of single factor experiment. Result:By single factor experiment,enzymolysis temperature 50 ℃,ultrasonic power 360 W,ultrasonic time 20 min were determined.The results of response surface methodology showed that the optimal extraction conditions were enzyme concentration 1.9%,ratio of compound enzyme 2∶1,enzymolysis time 138 min,liquid material ratio 30∶1(mL/g). Conclusion:Under the optimal extraction conditions,the yield of polysaccharide reached 40.56%.

Armillariamellea;polysaccharide;ultrasonic;cellulase;papain

2016-10-11

陳超(1993-),女,碩士研究生,研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:18846921675@163.com。

*通訊作者:于國萍(1963-),女,博士,教授,研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:yuguopingneau@hotmail.com。

TS255.1

A

1002-0306(2017)08-0222-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.035