分光光度法分析水果酵素中功效酶活性的研究

陳 爽,朱忠順,高妍妍,朱顯峰

(河南大學生命科學學院生物工程研究所,河南開封 475004)

分光光度法分析水果酵素中功效酶活性的研究

陳 爽,朱忠順,高妍妍,朱顯峰*

(河南大學生命科學學院生物工程研究所,河南開封 475004)

目的:利用分光光度法分別測定水果酵素中多種功效酶的活性。方法:借助分光光度計,采用3,5-二硝基水楊酸法、福林法、銅皂法和鄰苯三酚終止法分別對液狀水果酵素中淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及超氧化物歧化酶的活力進行測定。結果:液狀水果酵素中淀粉酶活力為1.968 U/mL,蛋白酶活力為5.421 U/mL,脂肪酶活力為1.106 U/mL,超氧化物歧化酶活力為10.758 U/mL。結論:液狀水果酵素中SOD酶活性最高,蛋白酶次之,淀粉酶和脂肪酶活性較低;后續實驗中可優化發酵條件來提高其中的淀粉酶與脂肪酶活力。

水果酵素，淀粉酶,蛋白酶,脂肪酶,超氧物歧化酶,酶活力

“諾貝爾化學獎得主波以爾教授說:如果人像燈泡,酵素就是電流,沒有電流(酵素)燈泡就不亮。沒有酵素就沒有生命”[1]。酵素有個正式的名字——酶,它的產生類似釀酒,由微生物以水果為底物發酵產生;并且在微生物代謝的過程中產生了多種活性物質,如各種有機酸、酚類、氨基酸、維生素、礦物質、酶等[2]。身體中酵素的多少及其活性高低和人體的衰老與疾病息息相關。隨著年齡的增加,人體內的酵素數量與活力都在下降[3]。而液狀水果酵素的制作衛生環保,因此,可通過食用酵素來調節體內酶的含量,進而預防現代文明病、解酒護肝、美容[4]。另一方面,酵素在食品和醫藥等領域中具有很廣泛的應用,一些生物酵素產品開始應用于農牧業中[5-7]。

功效酶是水果酵素中的主要活性物質之一,其中,蛋白酶可水解蛋白質肽鏈,食物攝取的蛋白質可以被體內的蛋白酶分解為易于被人體吸收的氨基酸,增加體內的營養吸收;在面包生產中能改變面筋性能[8]。其中胰蛋白酶可以使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散,胃蛋白酶能消化食物中的蛋白質,如向豆餅飼料中添加蛋白酶,可以增強保育豬對豆餅中氨基酸的消化[8]。淀粉酶通常能夠把糖類催化水解為易于人體吸收利用的小分子物質,對于動物包括人類有增強消化的功能。據孟慶紅報道,α-淀粉酶在面包生產工藝中有助于面包的起發,在焙烤工藝中可增大面包體積、提高面包柔軟度、延緩面包老化速度[9]。有文獻指出一些耐熱性相對較低的細菌α-淀粉酶是有效的抗老化劑[10]。脂肪酶能夠逐步將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸,也可非專一降解殼聚糖以及水-有機界面間的不溶底物[11-12];超氧物歧化酶(SOD)是生物體系中抗氧化酶系的重要成員,專一催化超氧陰離子發生歧化反應,有效防御生物體內活性氧對機體的傷害,可作為食品抗氧化劑或蔬菜水果的保鮮劑,對自身免疫病、心腦血管疾病等都有顯著療效[13-14],還可延緩皮膚衰老、祛色斑[9]。

功效酶的活力是水果酵素的主要質量指標,目前對酵素中功效酶的活性檢測較少,其中有相關文獻報道了微生物酵素中3種功效酶的活力,然而其種類不夠全面[15]。本文系統的研究了水果酵素中主要功效酶的活力,完善了酶的測定種類及液狀水果酵素中酶活性與樣品濃度的關系。測定水果酵素功效酶的活性,可以更加有據的評價酵素的質量,提高人們對酵素的認可度,若能通過使用水果酵素來增加各種酶的功效,將對開發利用水果酵素保健食品、日化產品、化妝品、醫藥及環境治理的應用等有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

國產紅提、紅富士蘋果、庫爾勒香梨、香橙、蜜柚、國產火龍果、香蕉、檸檬、獼猴桃、白砂糖 均為市售優品;麥芽糖、可溶性淀粉、氫氧化鈉、硫酸銨、檸檬酸、檸檬酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鈉、Folin-酚、三氯乙酸、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、L-酪蛋白、L-酪氨酸、醋酸銅、吡啶、油酸、甲苯、鹽酸、Tris、鄰苯三酚、抗壞血酸 以上試劑均為分析純;金龍魚精煉一級大豆油 市售。

Eppendorf 5810R臺式高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司;INESA 752N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;其他儀器 驗室常規儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 液狀水果酵素的制備 將水果洗凈、晾干后分別稱重,其中國產紅提300 g,紅富士蘋果600 g,庫爾勒香梨250 g,香橙250 g,蜜柚250 g,國產火龍果250 g,香蕉100 g,檸檬200 g,獼猴桃200 g。將白砂糖、水果和水按照1∶8∶10的比例放入發酵罐,把罐體密封好置于陰涼處(室溫25～30 ℃)發酵,每隔3 d于無菌操作臺中通氣一次,實驗過程中通過紫外照射操作臺避免染菌,罐體表面及取樣口用75%酒精消毒,靜置發酵30 d。對發酵完成的液狀水果酵素置于超凈工作臺中進行無菌取樣,以4000 r/min、6 ℃條件下離心10 min后取上清液,按7∶13(v∶v)加入飽和硫酸銨,4 ℃條件下鹽析2 h后的上清液即為粗酶液,保存備用。

1.2.2 淀粉酶活力的測定

1.2.2.1 標準曲線的制作 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麥芽糖,而麥芽糖與3,5-二硝基水楊酸反應生成棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸,可在520 nm測定其吸光度,從而計算出發酵液中淀粉酶活力[15]。按照表1的操作,在波長520 nm處測定溶液的吸光度,以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

表1 淀粉酶標準曲線的制作Table 1 The standard curve making of amylase

1.2.2.2 活力的測定 分別將0.5 mL磷酸緩沖液、粗酶液于50 ℃水浴中預熱3 min后混勻，加入2 mL 1%的淀粉溶液，50 ℃水浴反5 min立即加入4 mL已在沸水浴中預熱的3,5-二硝基水楊酸試劑，搖勻后于沸水浴中反應10 min；以1 mL蒸餾水代替麥芽糖標準液，作空白實驗。按標準曲線計算酶的濃度，然后以靳利娥[16]等的公式計算酶活力(U/mL)，如下：

X=c×V×n

式中，X為淀粉酶活力，U/mL；c為酶液中麥芽糖的濃度，μmol/mL；V消耗的粗酶液的體積，mL；n為酶液的稀釋倍數。

1.2.3 蛋白酶活力的測定

1.2.3.1 標準曲線的制作 參照GBT 23527-2009《蛋白酶制劑》[17],試劑的添加如表2所示，40 ℃水浴20 min,在波長680 nm處測得反應液的吸光度,以L-酪氨酸濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

表2 蛋白酶標準曲線的制作Table 2 The standard curve making of protease

1.2.3.2 活力的測定 分別取40 ℃預熱5 min的1%酪蛋白與經同樣預熱的不同濃度粗酶液1 mL,于試管中40 ℃水浴反應10 min后,立即依次加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL,搖勻后靜置10 min,用慢速定性濾紙進行過濾,取濾液1 mL依次加入5 mL Na2CO3溶液與1 mL Folin-試劑,40 ℃水浴顯色20 min后,在680 nm處測定吸光度值。對照實驗測定方法同上,唯在反應之前要先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL,使酶失活。參照標準曲線,計算酵素中蛋白酶的活力[18]。

1.2.4 脂肪酶活力的測定

1.2.4.1 標曲的制作 脂肪酶活力采用銅皂法進行測定[19]。按照表3添加試劑混合攪拌3 min后，4000 r/min離心10 min,取上層有機相測710 nm處吸光度值,以吸光度對油酸濃度作圖得到脂肪酶的標準曲線。

表3 脂肪酶標準曲線的制作Table 3 The standard curve making of lipase

1.2.4.2 活力的測定 根據脂肪酶分解大豆油產生的油酸分子與醋酸銅中的Cu2+生成綠色的絡合物,以4000 r/min轉速離心10 min后取上層有機相在710 nm處測定吸光度。分別取37 ℃水浴預熱5 min的3 mL磷酸鹽緩沖液與1 mL大豆油,混合磁力攪拌10 min,立即加入0.1 mL粗酶液,攪拌2 min后加8 mL甲苯,終止反應,同時萃取生成的脂肪酸。將反應液4000 r/min離心10 min,取上層有機相4 mL加入1 mL 5%醋酸銅顯色劑,磁力攪拌3 min,同條件離心10 min,取上層有機相,在波長710 nm處測其吸光度。以不含脂肪酶的空白溶液作參比,對照脂肪酸吸光度標準曲線,即可求得脂肪酸的濃度。

將一定條件下,每分鐘釋放出1 μmol脂肪酸的酶量定義為1個脂肪酶活力單位(U)。脂肪酶活力的計算參照江慧芳[19]的方法進行,如下公式:

X=(cV1)/(tV2)

式中,X為脂肪酶活力,U/mL;c為脂肪酸的濃度,μmol/mL;V1為脂肪酸溶液的體積,mL;t為作用時間,min;V2為消耗的粗酶液的體積,mL。

1.2.5 超氧物歧化酶(SOD)的活力測定 采用鄰苯三酚終止法[20-21],當鄰苯三酚自氧化反應后,于25 ℃水浴中迅速加入5%維生素C溶液,立即混勻、靜置,以終止自氧化反應,然后再測定反應液在325 nm處的吸光度。其中鄰苯三酚自氧化速率與SOD活性的測定依表4進行;SOD活力的計算參照許雅娟[21]的方法,如下公式:

X=(A0-Ai)/A0×18/V×N

式中,X為SOD活力,U/mL;A0為鄰苯三酚的自氧化率;Ai為反應液的吸光度;V為消耗的粗酶液的體積,mL;N為粗酶液的稀釋倍數。

表4 鄰苯三酚自氧化速率的測定Table 4 The detection of pyrogallol oxidation rate

1.3 數據處理

根據測得的各實驗數據,由酶活力公式計算出各種酶的活力,經Origin軟件進行數據分析,并選擇一組線性相關較高的數據,即r在0.885～0.999范圍內的一組數據繪制酶活力隨粗酶液濃度的變化曲線。

2 結果與分析

2.1 淀粉酶活力測定

2.1.1 標準曲線的制作 在波長520 nm處測得反應液的吸光度,以加入麥芽糖的質量含量為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線y=0.41167x-0.02252,R2=0.99724,見圖1。

圖1 麥芽糖標準曲線Fig.1 The standard curve of maltose

2.1.2 淀粉酶活力測定 以可溶性淀粉為底物,利用分光光度法測得淀粉酶活性,繪得各組酶活力測定曲線,由圖2可知,淀粉酶活性隨樣品濃度的增長而快速增長,當酶液濃度為10%左右時,淀粉酶活性最高,為1.968 U/mL。之后酶活性趨于穩定,可能是底物濃度太低,添加的酶量已將其完全催化所致,有待以后研究。

圖2 淀粉酶活性測定曲線Fig.2 The activity curve of amylase

2.2 蛋白酶活力測定

2.2.1 標準曲線的制作 借助分光光度計測得680 nm處的標準酪氨酸吸光度值,繪制酪氨酸標準曲線y=0.01061x+0.00595,其中R2=0.99928,說明酪氨酸與產物——藍色鉬藍和鎢藍的混合物呈現很好的線性關系,可以用此方法進行蛋白酶活力的測定,見圖3。

圖3 酪氨酸標準曲線Fig.3 The standard curve of tyrosine

2.2.2 蛋白酶活力測定 以L-酪蛋白為底物,采用分光光度法測得蛋白酶活性測定曲線,由圖4可知,隨酶液濃度的增加,蛋白酶活性基本呈線性、穩定增長,當粗酶液濃度為12%時,蛋白酶活力達到5.421 U/mL;因此可通過改變酵素液濃度的方式來改變其中的蛋白酶活力,進而可選擇不同濃度來應用于食品、化妝品及其他領域。由此也證明用酪氨酸做底物、以福林法測定水果酵素中蛋白酶的活力方法簡便,不易使液體狀態中的酶失活,結果可信度高。

圖4 蛋白酶活性測定曲線Fig.4 The activity curve of protease

2.3 脂肪酶活力測定

2.3.1 標準曲線的制作 實驗中分別以75%酒精、無水乙醇及正己烷來作為油酸溶液的溶劑,其中只有后者可以很好的相容,另兩者均出現不同程度的分層,不利于實驗的進行,因此選用正己烷作溶劑來進行實驗。通過測定油酸-正己烷溶液與醋酸銅的反應液在710 nm處的標準油酸吸光度值,得到油酸的標準曲線y=0.0653x+0.2728,其中R2=0.98461,線性良好,可以由此來測定脂肪酶的活力,如圖5。

圖5 脂肪酶標準曲線Fig.5 The standard curve of oleic acid

2.3.2 脂肪酶活力測定 以市售大豆油為底物,采用分光光度法測得脂肪酶活力的變化曲線,由圖6可知,雖然脂肪酶活力隨酶液濃度的升高而遞增,但是水果酵素中脂肪酶活力依然很低,當粗酶液濃度為12%時,脂肪酶活力僅能達到1.106 U/mL,因此可對酵素液進行濃縮,來增加脂肪酶的活力,或者以后優化實驗條件來提高水果酵素中脂肪酶的活力,進而擴大其在化妝品、保健產品、環境治理等方面的應用性。

圖6 脂肪酶活性測定曲線Fig.6 The activity curve of lipase

2.4 SOD活力測定

以5%的VC為底物,在325 nm處用鄰苯三酚終止法得SOD酶活性測定曲線,酶活力變化由圖7可知,隨著樣品濃度的增加,SOD酶活性基本呈線性增長(r=0.99);水果酵素濃度越高,其中的SOD活力越大;當粗酶液濃度為12%時,液狀水果酵素SOD活力達到10.758 U/mL,即對超氧陰離子的清除能力很強,證明液狀水果酵素的抗氧化能力較好。本研究可為大力開發微生物蛋白酶與SOD這一條很有前景的產業方向做好鋪墊。

圖7 SOD酶活性測定曲線Fig.7 The activity curve of SOD

3 結論

本實驗通過對液狀水果酵素中淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、SOD酶活力的測定,發現水果酵素中淀粉酶活力為1.968 U/mL,蛋白酶活力為5.421 U/mL,脂肪酶活力為1.106 U/mL,SOD酶活力為10.758 U/mL。其中SOD活性較高,蛋白酶次之,淀粉酶和脂肪酶活性較低;水果酵素中脂肪酶活力雖然較低,但可對酵素液進行濃縮,來線性增加脂肪酶的活力,提高其在去污、降脂等方面的應用性。直接測定液體酵素中功效酶的活力,避免了對產品加工過程中可能造成的酶活性改變,使實驗結果準確度更高,能為酵素的應用奠定更科學的理論基礎。

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Detection of efficacy enzyme activity in ferments of fruits by spectrophotometric method

CHEN Shuang,ZHU Zhong-shun,GAO Yan-yan,ZHU Xian-feng*

(College of Life Sciences Institute of Biological Engineering,Henan University,Kaifeng 475004,China)

Abjective:The efficacy enzyme activity in ferments of fruits was detected by spectro-photometric. Methods:In this study,by means of 3,5-dinitrosalicylic acid,folin method,copper soap method and pyrogallol autoxidation method,the activies of amylase,protease,lipase,and superoxide dismutase of fruit enzymes was performed respectively by a spectrophotometer. Results:The activities of amylase,protease,lipase and superoxide dismutase was 1.968 ,5.421,1.106,10.758 U/mL of fruit enzymes,respectively. Conclusion:The activities of superoxide dismutase was highest,then was protease activities,the activities of amylase and lipase in fruit-ferments was lower than them. The results obtained in this study should be helpful for optimum fermentation condition in order to receive a high activity in further research.

ferments of fruits;amylase;protease;lipase;superoxide dismutase;enzyme activity

2016-08-29

陳爽(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：生物物質分離，E-mail：chans_9009@163.com。

*通訊作者:朱顯峰(1973-)，男，教授，主要從事微生物與生化藥學方面的研究，E-mail：zhuxf73@163.com。

教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目(20124103120002)；河南省科技攻關計劃項目(132102310421)；河南大學研究生優秀學位論文培育計劃(理學碩士)(Y1425010)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)08-0218-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.034