茅臺(tái)地區(qū)醬香型酒糟中高溫放線菌的分離鑒定

白成松,陳 莉，*,盧紅梅,周 蓮,任勰柯

(1.貴州大學(xué)食品與釀酒工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550003; 2.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550003)

茅臺(tái)地區(qū)醬香型酒糟中高溫放線菌的分離鑒定

白成松1,陳 莉1，*,盧紅梅2,周 蓮2,任勰柯2

(1.貴州大學(xué)食品與釀酒工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550003; 2.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550003)

從茅臺(tái)地區(qū)醬香型酒糟中篩選出耐高溫菌株,編號(hào)為DF。對(duì)其進(jìn)行個(gè)體形態(tài)觀察、菌落形態(tài)觀察、16S rDNA基因序列分析以及其對(duì)淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)等的降解能力的研究,結(jié)果表明,菌株DF菌落干燥緊實(shí)、基內(nèi)暗黃色、表面白色粉狀、不透明,生長(zhǎng)溫度范圍為35～60 ℃,最適生長(zhǎng)溫度為55 ℃,通過(guò)16S rDNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析,可以初步鑒定菌株DF為產(chǎn)色高溫單孢菌(Thermomonosporachromogena)。該菌株對(duì)淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)有一定的降解能力,可以用作降解酒糟的菌劑。

醬香型酒糟,高溫放線菌,分離鑒定,16S rDNA

隨著社會(huì)不斷發(fā)展,人民生活水平的提高,白酒產(chǎn)量也不斷增加,其生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物-酒糟量也隨之增加,僅2015年貴州省的白酒酒糟量就達(dá)到100多萬(wàn)噸[1]。白酒鮮酒糟含水量大,加之又具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,含有淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)等,使其不耐貯存,如果不處理直接丟棄在環(huán)境中,就會(huì)造成酒糟資源的巨大浪費(fèi),還會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。因此,對(duì)白酒酒糟的處理已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。我國(guó)對(duì)酒糟研究起步較晚,近年來(lái)隨著人們對(duì)酒糟資源的逐漸重視,在酒糟的綜合利用方面開(kāi)始加大資金投入和科研力度,取得了較大的進(jìn)展,主要的應(yīng)用包括生產(chǎn)飼料、有機(jī)肥、食用菌、食醋、制曲、高附加值生化產(chǎn)品、沼氣等,有效利用好白酒酒糟不僅能降低丟糟造成的環(huán)境污染,還能大幅提高白酒副產(chǎn)物的附加值,但這些應(yīng)用對(duì)酒糟的綜合利用能力仍顯不足。其中,有效利用酒糟生產(chǎn)有機(jī)肥是解決大量酒糟利用問(wèn)題的重要方案。

高溫菌是一類能在45 ℃以上生長(zhǎng)和繁殖的微生物,具有耐熱嗜熱,降解性能好,代謝效率高等特點(diǎn),在很多領(lǐng)域都發(fā)揮著重要的作用[2-4]。利用高溫菌產(chǎn)生耐熱酶，其特性能很好地加快酒糟成分的降解,明顯縮短堆肥周期,把酒糟堆肥發(fā)酵為有機(jī)肥,這樣,不僅能有效解決農(nóng)作物肥料供應(yīng)問(wèn)題,還能解決酒糟資源化利用的問(wèn)題[5-8]。目前,國(guó)內(nèi)外暫沒(méi)有關(guān)于白酒酒糟中高溫放線菌的研究和應(yīng)用,但有關(guān)于白酒酒糟中高溫細(xì)菌的研究,用于研究酒糟復(fù)合菌劑,主要針對(duì)于貴州省[9]。因此,可以參考酒糟中高溫細(xì)菌的研究方法,從酒糟中篩選大量降解性能好的優(yōu)良高溫菌株,并深入了解其特性,以便能夠更好地利用高溫菌資源,拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。

本研究從茅臺(tái)地區(qū)醬香型白酒酒糟中分離篩選出耐高溫菌株,通過(guò)對(duì)其進(jìn)行分離鑒定和特性研究,以期為后續(xù)高溫菌劑和白酒酒糟生物有機(jī)肥的制備奠定基礎(chǔ),這對(duì)于提高我省大量的酒糟資源的綜合利用,拓寬高溫菌的應(yīng)用范圍,促進(jìn)我國(guó)白酒產(chǎn)業(yè)的更好發(fā)展以及環(huán)境保護(hù)都將具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬香型白酒酒糟 取自貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)第七輪次拋糟的醬香型白酒酒糟(取樣時(shí)間:2013年5月,酒糟淀粉含量:15.3%;蛋白質(zhì)含量:8.5%;脂肪含量:3.0%;水分含量:61.5%);碘化鉀、碘(分析純) Guizhou Sciencelab science &Technology Co.,Ltd.;無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇(分析純) 天津市富宇精細(xì)化工有限公司;可溶性淀粉(分析純) 天津市永大化學(xué)試劑有限公司;高蛋白脫脂高鈣奶粉(調(diào)制乳粉) 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司;羧甲基纖維素鈉(分析純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;氯化鈉(分析純) 成都臨江化工廠;剛果紅 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;高氏一號(hào)培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基 按文獻(xiàn)[10]進(jìn)行配制。

BCD-290W冰箱 青島海爾股份有限公司;DMS-653廣西生物數(shù)碼顯微鏡 深圳市博宇儀器有限公司;∑IGMAZEISS電子掃描顯微鏡 北京普瑞賽司儀器有限公司;SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱 上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YXQ-L S-5 D S 11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DHG-9140B(101-2B)智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SN-CJ-IF潔凈工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酒糟中高溫放線菌的分離篩選 在潔凈工作臺(tái)中,將醬香型白酒酒糟制成不同稀釋梯度的菌液,再將稀釋菌液均勻涂布在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上,然后倒置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中55 ℃培養(yǎng)24 h。仔細(xì)觀察菌落特征和個(gè)體形態(tài),將不同特征的生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落用無(wú)菌接種針挑出,在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)過(guò)程(7～8次),得到了純種的高溫菌。

1.2.2 微生物形態(tài)特征 菌落形態(tài):挑選分離純化的菌株,用平板劃線的方法接種在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上,55 ℃培養(yǎng)12～24 h,觀察菌落的的大小、形態(tài)、顏色、邊緣等特征。個(gè)體形態(tài):放線菌采用印片法,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

1.2.3 最適生長(zhǎng)溫度 將在冰箱中保存的菌株在高氏液體培養(yǎng)基中活化1 d,取活化液涂布在高氏培養(yǎng)基平板上,置于35、40、45、50、55、60 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每個(gè)溫度條件下培養(yǎng)3組,待菌落長(zhǎng)到一定大小后,用十字交叉法測(cè)定菌落直徑大小,取平均值,并繪制菌株的最適生長(zhǎng)溫度測(cè)量曲線圖。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線 菌株的活化采用裝有100 mL液體高氏一號(hào)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶,50 ℃,120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)1 d。吸取1 mL搖勻的菌液,接種到裝有100 mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng),每種菌株做3組,置于50 ℃,120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng),每隔1 d將三角瓶取出置于冰箱中保存,共測(cè)5 d,待全部培養(yǎng)結(jié)束后,依次將培養(yǎng)液用真空泵抽濾于定量濾紙上,再用蒸餾水清洗浸泡,再用真空泵抽濾于定量濾紙上,重復(fù)三次。最后在100 ℃條件下烘箱烘至恒重后,電子天平稱量與之前定量濾紙的重量差,即為菌體干重,求出每組菌體干重平均值,并繪制菌株的生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.5 微生物基因組DNA的提取 利用TIANamp Bacteria DNA Kit(天跟生化科技有限公司)提取實(shí)驗(yàn)菌株的DNA,其具體步驟參見(jiàn)試劑盒的說(shuō)明書。DNA提取產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.6 16S rDNA基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序 以提取的基因組DNA為模板,利用通用引物正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCTAG-3′)和反引物14928(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有PCR均在5 μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,52 ℃復(fù)性1 min,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);最后于72 ℃延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)回收PCR產(chǎn)物。純化后的目的基因送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件參照正反序列圖譜進(jìn)行人工校正。

1.2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 用基本局部比對(duì)搜索工具(basic local alignment cearchtool,BLAST)將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(national center of biotechnology information,NCBI)中與己知細(xì)菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性分析,并用MEGAS.10軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,具體確定菌株的種屬。

1.2.8 菌株的淀粉降解特性實(shí)驗(yàn) 將淀粉降解培養(yǎng)基融化,倒入平板,凝固后將平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。在平板培養(yǎng)基上點(diǎn)種,分別在50 ℃和55 ℃的條件下培養(yǎng)3 d,每個(gè)溫度條件設(shè)置3個(gè)平板,待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后,在平板上滴加盧戈氏碘液,觀察記錄透明圈大小,并計(jì)算Hc值(透明圈的直徑和其菌落直徑的比值),根據(jù)Hc值的大小可以判斷微生物分解淀粉能力的強(qiáng)弱[9]。

1.2.9 菌株的纖維素降解特性實(shí)驗(yàn) 配制纖維素降解培養(yǎng)基,倒入平板,凝固后將平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。在平板培養(yǎng)基上點(diǎn)種,分別在50 ℃和55 ℃的條件下培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)3 d后,在平板中倒入沒(méi)過(guò)培養(yǎng)基的1 g/L的剛果紅溶液,浸泡30 min,再用1 mol/L的NaCl溶液浸泡30 min,觀察記錄透明圈大小,并計(jì)算Hc值(透明圈的直徑和其菌落直徑的比值),根據(jù)Hc值的大小可以判斷微生物分解纖維素能力的強(qiáng)弱[10]。

1.2.10 菌株的蛋白質(zhì)降解特性實(shí)驗(yàn) 配制蛋白質(zhì)降解培養(yǎng)基,倒入平板,凝固后將平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。在平板培養(yǎng)基上穿刺接種,分別在50 ℃和55 ℃的條件下培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)3 d后,觀察記錄透明圈大小(乳黃色褪去的面積大小[10]),并計(jì)算Hc值,根據(jù)Hc值的大小可以判斷微生物分解蛋白質(zhì)能力的強(qiáng)弱。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次,數(shù)據(jù)應(yīng)用origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

通過(guò)高溫菌分離純化實(shí)驗(yàn)得到一株高溫菌,編號(hào)為DF,其菌落形態(tài)和菌株鏡檢圖片分別見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 菌株DF的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of strain DF

圖2 菌株DF的鏡檢Fig.2 Microscopic examination of strain DF

由圖1可以看出,菌株DF菌落表面干燥緊實(shí)、基內(nèi)暗黃色,表面白色粉狀、不透明、難挑取,菌落直徑約為7 mm。由圖2可以看出,菌絲體纖細(xì),直徑0.3～0.4 μm,無(wú)橫隔膜、不斷裂,可能為放線菌。

2.2 最適生長(zhǎng)溫度

從圖3可以看出,菌株DF在55 ℃下生長(zhǎng)的菌落最大,因此它的最適生長(zhǎng)溫度為55 ℃。菌株DF在35～60 ℃均能生長(zhǎng),其菌落大小呈先增長(zhǎng)后下降趨勢(shì)。在35～55 ℃內(nèi),菌株DF菌落大小值呈不斷上升,在55 ℃時(shí)達(dá)到最大值,隨后菌落大小逐步下降,到60 ℃時(shí),菌株不再生長(zhǎng)。

圖3 菌株DF的最適生長(zhǎng)溫度Fig.3 The optimum growth temperature curve of strain DF

2.3 菌株的生長(zhǎng)曲線

從圖4中可以看出,菌體干重隨著培養(yǎng)時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),在培養(yǎng)的第1～3 d之間,菌體干重呈直線增加,到第3 d達(dá)到最大值,第3 d以后開(kāi)始下降。從菌體DF干重的變化趨勢(shì)來(lái)看,菌株DF發(fā)酵周期在第3 d。

圖4 菌株DF的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of strains DF

2.4 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)16S rDNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)在1000～2000 bp正中間處有一明亮條帶,測(cè)序結(jié)果為1522 bp,與檢測(cè)結(jié)果相符合,電泳圖如圖5所示。將菌株DF的16S rDNA基因序列測(cè)序結(jié)果與NCBI中已報(bào)道的模式菌株序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明,菌株DF與Thermomonosporachromogena的置信度到達(dá)99%。用MEGA5.10構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所示,通過(guò)與進(jìn)化關(guān)系比較親近的屬種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析,菌株DF屬于高溫單孢菌屬(Thermomonospora),與高溫單孢菌屬中的

圖5 菌株DF的16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.5 16S rDNA PCR amplification electrophoretoaram of strains DF注:M為Marker,DF、DF是同一菌株。

圖6 菌株DF基于16S rDNA建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The of phylogenetic tree of strain DF based on 16S rDNA sequence

Thermomonosporachromogena親緣關(guān)系最近,兩者在同一進(jìn)化分支上。結(jié)合菌株DF的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析可以初步鑒定菌株DF是產(chǎn)色高溫單孢菌(Thermomonosporachromogena)。

2.5 菌株的降解特性實(shí)驗(yàn)

從表1可以看出,菌株DF對(duì)淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)都有一定降解能力,在不同溫度下,菌株DF對(duì)淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)降解能力也各不同。菌株DF在55 ℃條件下對(duì)淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)的降解能力比在50 ℃條件下對(duì)淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)的降解能力要強(qiáng),其中的機(jī)理還需進(jìn)一步研究,但可以通過(guò)控制培養(yǎng)溫度來(lái)調(diào)節(jié)菌株DF對(duì)淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)的降解能力。

表1 菌株DF降解淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of degrading of starch,cellulose and protein

3 結(jié)論

從茅臺(tái)地區(qū)醬香型酒糟中分離篩選出一株耐高溫菌株,編號(hào)為DF。通過(guò)對(duì)菌株DF的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析可以鑒定菌株DF為產(chǎn)色高溫單孢菌(Thermomonosporachromogena)。其生長(zhǎng)溫度范圍為35～60 ℃,最適生長(zhǎng)溫度為55 ℃。由菌株DF進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)可知,菌株DF能夠一定程度上降解淀粉、纖維素和蛋白質(zhì),在不同的溫度條件下,對(duì)淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)降解能力也各不同,55 ℃條件下對(duì)淀

粉、纖維素和蛋白質(zhì)的降解能力比在50 ℃條件下對(duì)淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)的降解能力要強(qiáng)。菌株DF從白酒酒糟分離得到,又具有降解淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)的特性,所以可以將其應(yīng)用到降解白酒酒糟中淀粉、蛋白質(zhì),纖維素上來(lái),一方面解決了我省大量酒糟貯存問(wèn)題和對(duì)其處理的問(wèn)題,治理了環(huán)境;另一方面又變廢為寶,將酒糟變成可再次利用的資源,節(jié)約了資源。

[1]宇博智業(yè).2014-2018年中國(guó)自酒行業(yè)市場(chǎng)研究與預(yù)測(cè)報(bào)告[R].北京:中國(guó)報(bào)告大廳,2015.

[2]郭春雷,彭謙.高溫菌研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志,2003,20(4):1-3.

[3]董錫文,薛春梅,吳玉德.極端微生物及其活應(yīng)機(jī)理的研究講展[J].微牛物學(xué)雜志,2005(1):74-77.

[4]宮曉梅,張磊,孫嘉,等.高溫菌劑的添加時(shí)間對(duì)污泥堆肥指標(biāo)影響研究[J].環(huán)境工程,2013,31(4):114-117.

[5]曹井國(guó),招樹欣,程麗娟,等.高溫菌及其在有機(jī)廢液處理中的應(yīng)用[J].工業(yè)水處理,2006,26(1):9-12.

[6]Jaenicke R,Sterner R. Life at High Temperatures[M]. The Prokaryotes. Berlin:Springer Berlin Heidelberg,2013:337-374.

[7]胡德全,漆英,余國(guó)華,等.酒糟飼料在肉牛生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].營(yíng)養(yǎng)與日糧,2014(8):44-47.

[8]郭春雷,成妮妮,劉明河,等.高溫菌16S rRNA與耐熱性關(guān)系的初步研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2005,32(5):1l4-117.

[9]周蓮,陳莉,盧紅梅,等.茅臺(tái)地區(qū)醬香型酒糟中高溫細(xì)菌的分離鑒定[J].中國(guó)釀造,2016,35(3):61-65.

[10]唐赟,劉沐之,梁鳳來(lái),等.一株嗜熱菌的分離鑒定及其苯酚降解特性[J].微生物學(xué)通報(bào),2006,33(5):39-44.

[11]王冬梅,白復(fù)芹.嗜熱酶的穩(wěn)定性及其應(yīng)用前景[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版版,2006,37(3):477-478.

Isolation and identification of thermoactinomycete from Moutai-flavor vinasse in Moutai region

BAI Cheng-song1,CHEN Li1，*,LU Hong-mei2,ZHOU Lian2,REN Xie-ke2

(1.College of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550003,China;2.Guizbou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy,Guizhou University,Guiyang 550003,China)

High temperature resistant strains were isolated from Moutai-flavor vinasse,numbered as DF. The individual morphology and colony morphology were observed,and the 16S rDNA gene was sequenced,and starch,cellulose and protein degradation ability of high temperature resistant strains were studied. The results showed that colony of the strain DF was dry and tight,and the inside of the medium was dark yellow,and the surface had a white and opaque powder. The growth temperature ranged from 35 to 60 ℃. The optimum growth temperature was 55 ℃. The strain DF was identified preliminarily asThermomonosporachromogenaby 16S rDNA gene sequences analysis and phylogenetic tree analysis. The strain had some degradation ability of starch,cellulose and protein. It could be used as bacteria agent of lees degradation.

Moutai-flavor vinasse;thermoactinomycetes;isolation and identification;16S rDNA

2016-09-01

白成松(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail:980235395@qq.com。

*通訊作者:陳莉(1981-)，女，碩士，副教授，研究方向：微生物，E-mail:chen_ccll@126.com。

貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合LH字[2016]7453號(hào))；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(2016055)。

TS262.3

A

1002-0306(2017)08-0199-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.030