甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物對α-淀粉酶的抑制作用

盧 桃,尹忠平,彭大勇,朱娟娟,鄒 凱,劉澤波

(江西農業大學,江西省天然產物與功能食品重點實驗室,食品科學與工程學院,江西南昌 330045)

甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物對α-淀粉酶的抑制作用

盧 桃,尹忠平*,彭大勇,朱娟娟,鄒 凱,劉澤波

(江西農業大學,江西省天然產物與功能食品重點實驗室,食品科學與工程學院,江西南昌 330045)

本文建立了微量α-淀粉酶抑制劑體外活性檢測模型,并以此模型研究了甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物對α-淀粉酶的抑制作用效果及其動力學特征。優化后的α-淀粉酶抑制劑活性檢測模型的主要參數如下:酶濃度為1.25 U/mL,底物濃度范圍為0.05～6 mg/mL,反應時間為30 min。以此模型檢測了由ACCC10060、R1601、A4三種發根農桿菌所誘導的甜葉菊毛狀根總綠原酸提取物對α-淀粉酶的抑制效果,發現三者均對α-淀粉酶具有較強的抑制作用,其IC50分別為12.43、18.31和21.08 mg/mL。高效液相色譜檢測結果表明,ACCC10060所誘導的甜葉菊毛狀根的總綠原酸提物主要含綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸三種成分,含量分別為6.88、19.90和1.50 mg/g。酶抑制動力學檢測結果顯示,該三種綠原酸類化合物均對α-淀粉酶有較強抑制作用,以該三種綠原酸標品復配模擬毛狀根總綠原酸提取物,發現其對α-淀粉酶的抑制作用與總綠原酸提取物無顯著性差異。以上研究結果表明,甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物對α-淀粉酶有很好的抑制作用,其有效成分為綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸,可利用該毛狀根生產以綠原酸類物質為主要活性成分的餐后血糖抑制劑。

甜葉菊,毛狀根,綠原酸類化合物,α-淀粉酶抑制劑

糖尿病是一種常見內分泌代謝性疾病[1],已逐漸成為威脅人類健康的第三大疾病。世界衛生組織2011年的統計數據表明,全球糖尿病患者已達3.71億人,而我國的糖尿病患者約1.14 億人,占全球糖尿病患者的30.1%,其中絕大多數屬Ⅱ型糖尿病[2]。糖尿病已對我國社會經濟發展及人民健康產生了巨大的威脅。高血糖是糖尿病的重要特征,也是引起血管病變及多種糖尿病并發癥的主要原因[3-5]。因此,控制血糖水平對預防和治療糖尿病來說極其重要。

α-淀粉酶是一種影響飲食中淀粉等碳水化合物消化和吸收的關鍵酶之一,抑制其酶活性可以減緩人體對淀粉等物質的水解,從而抑制餐后血糖的升高。因此,α-淀粉酶抑制劑經常被用于治療 II 型糖尿病,可降低餐后血糖水平和糖尿病并發癥的發生[6]。目前市面上銷售的餐后血糖控制劑有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等,這些化學合成藥物有較好的效果,但是毒副作用也較大,并且有脹氣、嘔吐等副作用,所以從天然植物中尋找高效、副作用小的α-淀粉酶抑制劑引起了研究人員的廣泛關注[7-20]。

研究表明,綠原酸類化合物具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌、降脂降糖、免疫調節等多種功效,在食品、保健、醫療和日用化工等領域有廣泛的應用[9]。本文建立了α-淀粉酶體外消化模型,以此模型研究了ACCC10060、R1601、A4三種發根農桿菌所誘導的甜葉菊毛狀根綠原酸提物對α-淀粉酶的抑制效果,并明確了其中的主要活性成分,以期為甜葉菊毛狀根生產餐后血糖抑制劑提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜葉菊毛狀根ACCC10060、R1601、A4三種發根農桿菌所誘導的甜葉菊毛狀根 均由江西省天然產物與功能食品重點實驗室選育和培養;WPM培養基(生化試劑) 青島高科園海博生物技術有限公司;可溶性淀粉(分析純) 西隴化工股份有限公司;豬胰α-淀粉酶(13 U/mg) Sigma公司;綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸標準品(純度>98%) 上海同田生物科技有限公司;甲醇(色譜純) 美國Tieda試劑有限公司；1 mol/L pH6.8 Tris-HCl 緩沖液 北京索萊寶科技有限公司;3,5二硝基水楊酸(純度>98%) 國藥集團化學試劑有限公司;酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、結晶酚、亞硫酸鈉、氯化鈉等化學藥品 均為國產分析純。

Aglient 126型高效液相色譜儀 美國Aglient科技有限公司;SpectraMax M2酶標儀 Molecular Devices。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑的配制 1 mg/mL葡萄糖標準液:準確稱取100 mg葡萄糖置于小燒杯中,加入少量去離子水溶解后,轉移到100 mL容量瓶中,用去離子水定容至100 mL,混勻。置于4 ℃冰箱中保存備用。

顯色劑(DNS)的配制:將6.3 g 3,5-二硝基水楊酸和262 mL NaOH溶液加到500 mL含有185 g 酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,再加入5 g結晶酚和5 g亞硫酸鈉,攪拌溶解,冷卻后加蒸餾水定容至1000 mL,儲存于棕色瓶中備用。

α-淀粉酶:將α-淀粉酶凍干粉溶于含1‰ Ca2+的8%的生理鹽水中,配制成20 U/mL的酶溶液,分裝,4 ℃儲存備用。

淀粉溶液:稱取適量可溶性淀粉,置于0.05 mol/L pH6.8 Tris-HCl 緩沖液中,混勻,然后置于沸水浴中加熱15 min后冷卻至室溫,制得系列濃度的淀粉溶液。

1.2.2 材料預處理 甜葉菊毛狀根的處理:在WPM無激素液體培養基中培養,20 d后收獲,以蒸餾水沖洗干凈,60 ℃烘干至恒重,磨成粉末,過60目篩,備用。

1.2.3 還原糖測定標準曲線的繪制 取不同體積的葡萄糖標準溶液(1 mg/mL)加入到2 mL離心管中(反應液中葡萄糖的終濃度分別為0、50、100、150、200、250、300 μg/mL),分別加入400 μL的DNS,再以蒸餾水補足至1000 μL,搖勻。在沸水浴中準確加熱5 min,取出后迅速置于冰浴中冷卻至室溫。取100 μL反應液于96孔板,加入100 μL蒸餾水,混勻,在波長λ=540 nm下測定吸光度值。以葡萄糖的量(μg)為縱坐標,OD值A為橫坐標,繪制還原糖測定標準曲線(以葡萄糖計)。

1.2.4α-淀粉酶體外消化模型 根據Udupa等[11]的方法并略作修改,總反應體系體積為1 mL,其中糊化好的可溶性淀粉溶液0.96 mL,α-淀粉酶溶液0.02 mL,0.05 mol/mL pH6.8 Tris-HCl緩沖液補足置于離心管中,混勻后立即置于37 ℃水浴中反應30 min,反應結束后迅速置于沸水中,滅酶20 min。取反應液300 μL,按1.2.3所述的方法測定其中的還原糖。

1.2.5α-淀粉酶體外反應模型主要參數的實驗設計

1.2.5.1 底物濃度的確定 為了測量結果準確,誤差小,本文進行了預實驗,選擇了濃度為0.05、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.75、2、2.5、3、3.5、4、5 U/mL的α-淀粉酶在一系列底物濃度為0、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL條件下進行預實驗。根據預實驗結果,將模型中α-淀粉酶的濃度定為1.25 U/mL,以濃度分別為0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL糊化好的淀粉溶液為底物,按照1.2.4所述的方法進行體外消化反應,在波長λ=540 nm下測定吸光值。以吸光值(OD)對底物濃度(S)作圖，以確定適合的底物濃度范圍。

1.2.5.2 反應時間的確定 將模型中α-淀粉酶的濃度設為1.25 U/mL、底物濃度分別設為0.25、0.5、1、2、3、4、5、6 mg/mL,按照1.2.4所述的方法進行反應,每隔10 min測定一次吸光值(OD),連續測70 min。以吸光值(OD)對時間(T)作圖，尋找模型恒速反應時間段,以確定最佳反應時間。

1.2.6 甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物的提取和測定

1.2.6.1 甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物的提取 分別稱取200 mg由ACCC10060、R4、R1601三種發根農桿菌所誘導的甜葉菊毛狀根粉末,以 50%(v/v)2 mL甲醇為提取溶劑,常溫超聲波輔助提取30 min,4000 r/min離心10 min,取上清液,定容,4 ℃儲存備用[10]。

1.2.6.2 綠原酸類化合物標準品溶液的配制 分別準確稱取綠原酸、3,5-二咖啡奎寧酸和4,5-二咖啡奎寧酸標準品各2 mg,以1 mL甲醇超聲溶解,配制2 mg/mL的標準溶液,再吸取一定量的標準溶液進行稀釋,配制成7個不同濃度的系列標準品溶液。

1.2.6.3 高效液相色譜測定方法 參考Fu等[10]的方法,具體檢測條件如下 Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:0.2%醋酸水(A)和甲醇(B);流速:1 mL/min;梯度洗脫程序:0～10 min:70% A;10～15 min:70%→45% A;15～25 min 45% A;25～26 min 45%→70% A;26～30 min:70% A;檢測波長:327 nm;柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL。

1.2.7 甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物對a-淀粉酶抑制活性的測定 按照1.2.4所述方法進行測定,以阿卡波糖為陽性對照物,主要操作步驟和參數如下:將濃度為1.25 U/mL的α-淀粉酶和待測抑制劑(綠原酸類化合物)按1∶1的體積比混勻,置于37 ℃ 水浴中孵育20 min,取0.04 mL上述混合液加到0.96 mL 1 mg/mL可溶性淀粉溶液中,混勻,37 ℃水浴反應30 min,立即置于沸水浴中滅酶20 min以終止反應,測量還原糖的生成量,計算反應速度。抑制活性以抑制百分率表示,計算公式如下:

I(%)=(V空白-V樣品)/V樣品×100

式中:I為抑制劑對淀粉酶的抑制活性(%),V空白為未添加抑制劑的空白實驗組反應速度(μg/min);V樣品為添加了待測抑制劑樣品的反應速度(μg/min)。

1.2.8 酶抑制動力學分析方法 按1.2.6.2所述方法分別配制不同濃度的綠原酸(濃度為0、0.07、0.1 mg/mL)、3,5-二咖啡酰奎寧酸(濃度為0、0.04、0.05 mg/mL)和4,5-二咖啡酰奎寧酸(濃度為0、0.07、0.08 mg/mL)三種標品物質,用于測定對α-淀粉酶抑制作用,采用雙倒數作圖法進行抑制動力學分析:以1/V對1/S(底物濃度S為 0.25、0.5、1、2、3、4、5、6 mg/mL)作圖,得到Lineweaver-Burk曲線,確定抑制類型,并計算Ki值。

1.2.9 標品復配模擬綠原酸類提取物及其對α-淀粉酶抑制活性的測定 從ACCC10060、R1601、A4三種發根農桿菌所誘導的甜葉菊毛狀根中篩選出對α-淀粉酶抑制作用效果較好的一種,根據HPLC測定結果,以綠原酸、3,5-二咖啡奎寧酸和4,5-二咖啡奎寧酸三種標準品進行復配,模擬綠原酸類化合物提取物,并按1.2.7所述方法進行抑制活性測定,以驗證抑制作用的主要活性成分。

2 結果與分析

2.1 還原糖測定標準曲線的繪制

為了準確測定α-淀粉酶-淀粉體外反應體系的反應速度,本文建立了還原糖測定標準曲線。實驗測定數據經擬合所得的回歸方程為Y=352.37X,式中:X為吸光度值,Y為還原糖的量(以葡萄糖計,μg),回歸方程的R2達到了0.9992,表明所建立的標準曲線在檢測范圍內線性良好,可用于后續實驗。

2.2α-淀粉酶體外抑制劑篩選模型的建立及主要參數的確定

為了使建立的模型能更好地適用于α-淀粉酶抑制劑的篩選及酶抑制動力學研究,本文對底物濃度和反應時間進行了確定。

2.2.1 底物濃度的確定 在α-淀粉酶濃度為1.25 U/mL的條件下,進行了底物濃度優化實驗,結果如圖1所示。由圖1可知,隨著底物濃度的增加，吸光度值(OD)先是快速上升，之后上升趨勢逐步變緩，當濃度達到4 mg/mL以后，吸光度值(OD)基本保持不變，此時生成的還原糖的量(Y=352.37X)和單位時間內反應速度(V=Y/T)也是先增加后不變，說明反應體系中的酶已被底物飽和。在底物濃度為0.25～6 mg/mL范圍內,反應速度曲線呈雙曲線形,速度和底物濃度之間的相關關系基本符合米氏方程。因此,底物濃度范圍確定為0.05～6 mg/mL。

圖1 不同底物濃度下的吸光值的變化Fig.1 The changes in absorbance at different substrate concentrations

圖2 不同底物濃度下70 min內的反應速度變化圖Fig.2 The change profile of reaction velocity under different substrate concentrations within 70 min

2.2.2 反應時間的確定 研究表明,在酶促反應開始的一段時間內,反應速度基本保持不變,之后隨著底物的消耗、產物的積累及部分酶分子失活,反應速度會逐步降低[12]。因此,酶促反應速度的測定應選在這個近似恒速反應階段進行。在酶濃度1.25 U/mL的條件下,測定了0.25～6 mg/mL底物濃度下連續反應70 min的反應速度,結果如圖2所示。由圖2可知,反應40 min以后,低底物濃度體系的吸光值增加趨勢變緩，即低底物濃度體系的反應速度開始顯現降低的趨勢,隨著時間的推移,高底物濃度下的反應速度也相繼出現了下降趨勢。底物濃度越高,出現下降趨勢的時間點越往后。據此可判定,在本模型所采用的條件下,前30 min反應基本處于恒速階段。為了確保低底物濃度下的反應在測定反應速度時仍處于恒速階段,本文將反應時間確定為30 min。

圖4 三種甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物提取物HPLC測定色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of authentic chlorogenic acid,3,5-dicaffeoylquinic acid, and 4,5-dicaffeoylquinic acid and three kinds of extracts from Stevia rebaudiana hairy roots注：1：綠原酸；2：3，5-二咖啡奎寧酸；3：4，5-二咖啡奎寧酸。

2.3 甜葉菊毛狀根綠原類提取物對α-淀粉酶的抑制效果

由圖3可知,在2.5～200 mg/mL毛狀根生藥濃度范圍內,來源于ACCC10060、R1601、A4三種農桿菌誘導的甜葉菊毛狀根的綠原酸類提取物對α-淀粉酶均具有一定的抑制作用。在2.5～50 mg/mL濃度范圍內,抑制率隨提取物物濃度的增加而增加,基本上呈線性正相關,但進一步提高提取物濃度時,抑制率不再升高。在本文所采用的模型條件下,三者的最大抑制率分別為81.23%,84.91%,83.32%,計算出來的IC50分別為12.43、18.31、21.08 mg/mL。由此可知,三種農桿菌所誘導的甜葉菊毛狀根的綠原酸類提取物對α-淀粉酶均有較好的抑制作用。

圖3 三種甜葉菊毛狀根的提取物對α-淀粉酶的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect on three kinds of Stevia rebaudiana hairy root extracts on α-amylase

2.4 HPLC定量檢測與分析

2.4.1 綠原酸類化合物標準曲線的繪制 按照1.2.6.3色譜條件,建立了綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸三種化合物的測定標準曲線(如表1所示)。三種化合物測定回歸方程在相應的檢測范圍內線性關系良好,可用于定量測定。

2.4.2 甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物的HPLC檢測 按照1.2.6.3色譜方法,對來源于ACCC10060、R1601、A4三種農桿菌誘導的甜葉菊毛狀根的綠原酸類化合物提取物進行了測定,結果如圖4所示。檢測結果表明,三種甜葉菊毛狀根中都含有綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸三種物質,但組成比例上有一定的區別。從三種物質的總含量表2來看,以ACCC10060毛狀根最高,其次為A4毛狀根。綠原酸含量以R1601毛狀根最高,含量為9.84 mg/g,3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸都以ACCC10060毛狀根為最高,含量分別為19.90,1.50 mg/g。

表1 綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸高效液相測定標準曲線Table 1 The regression equation of chlorogenic acid,3,5 dicaffeylquinic acid and 4,5 dicaffeoylquinic acid determination by HPLC

表3 三種綠原酸類化合物對α-淀粉酶抑制作用的動力學參數Table 3 The calculated kinetics parameters of α-amylase under the inhibition of chlorogenic acids

圖5 三種綠原酸類化合物對α-淀粉酶抑制作用的 Lineweaver-BurkFig.5 Lineweaver-Burk plot for inhibition of chlorogenic acids on α-amylase注:圖a、b、c分別為綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸對α-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk。

表2 三種毛狀根中綠原酸類化合物的含量Table 2 The content of chlorogenic acid compounds in three hairy roots

2.4.3 三種綠原酸類化合物對α-淀粉酶的抑制動力學檢測 為了明確甜葉菊毛狀根綠原酸類提取物對α-淀粉酶起抑制作用的主要成分及其作用機制,本文測定了不同濃度的綠原酸(濃度為0、0.07、0.1 mg/mL)、3,5-二咖啡酰奎寧酸(濃度為0、0.04、0.05 mg/mL)和4,5-二咖啡酰奎寧酸(濃度為0、0.07、0.08 mg/mL)三種標品物質對α-淀粉酶抑制作用效果,并采用雙倒數作圖法進行了抑制動力學分析,結果如圖5和表3所示。從雙倒數作圖的擬合效果來看,三種綠原酸類化合物作用下模型的1/V與1/S均呈現出了較好的線性關系,可用于抑制類型判斷和抑制動力學參數測定。由圖5a～圖5c可知,綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸作用下α-淀粉酶的表觀Km值沒有明顯變化,但表觀Vmax隨著抑制劑濃度的升高而變小了,表明該三種物質沒有改變酶對底物的親和力,但降低了最大反應速度,表現出了非競爭型抑制劑的典型特征。從表3中的Ki來看。三種物質中以綠原酸對α-淀粉酶的抑制作用最好。

2.4.4 甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物對α-淀粉酶抑制作用的驗證 從ACCC10060、R1601、A4三種發根農桿菌所誘導的甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物對α-淀粉酶的抑制作用效果來看,在2.5～37.5 mg/mL濃度范圍內ACCC10060誘導的毛狀根的提取物效果最好(如圖3所示)。本文根據HPLC測定結果,以綠原酸、3,5-二咖啡奎寧酸和4,5-二咖啡奎寧酸三種標準品進行復配,模擬濃度為12.5 mg/mL的ACCC10060所誘導毛狀根的綠原酸類化合物提取物,并進行抑制活性測定,以驗證抑制作用的主要活性成分。結果表明,復配模擬物對α-淀粉酶的平均抑制率為39.81%,統計分析顯示,提取物和復配物兩者對α-淀粉酶的抑制作用無顯著性差異。綜上所述,甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物對α-淀粉酶有較好的抑制作用,其主要活性成分為綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸三種物質。

3 結論

本文建立了微量α-淀粉酶抑制劑體外活性檢測模型,并以此模型研究了甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物對α-淀粉酶的抑制作用效果及其動力學特征。優化后檢測模型的主要參數如下:酶濃度為1.25 U/mL;底物濃度范圍為0.05～6 mg/mL,反應時間為30 min。ACCC10060,R1601,A4三種發根農桿菌菌種誘導的甜葉菊毛狀根的綠原酸類提取物對α-淀粉酶均有較好的抑制作用,其活性作用的主要成分為綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸。因此,可利用ACCC10060誘導的毛狀根生產以綠原酸類物質為主要活性成分的餐后血糖抑制劑。

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The inhibition onα-amylase of chlorogenic acids fromSteviarebaudianahairy coot cultures

LU Tao,YING Zhong-ping*,PENG Da-yong,ZHU Juan-juan,ZOU Kai,LIU Ze-bo

(Jiangxi Provincial Key Laboratory of Natural Products and Functional Food, Food Science and Engineering College,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

This paper established a model of alpha amylase inhibitor screeninginvitro,and researched the inhibitory effects and the dynamic characteristics of chlorogenic acid compounds extracted fromSteviarebaudianahairy roots through this model. The optimized parameters of this model were as follows:the enzyme concentration,substrate concentration,reaction temperature,and reaction time were 1.25 U/mL,0.05～6 mg/mL,37 ℃,and 30 minutes respectively. The inhibitory effect ofSteviarebaudianahairy roots(ACCC10060,R1601,A4)extracts onα-amylase was studied by this modle,and it found that they all had strong inhibitory effect onα-amylase and the IC50were 12.43,18.310 and 21.084 mg/mL respectively. The results of HPLC showed that total chlorogenic acid extract of Stevia hairy roots ACCC10060 mainly contains chlorogenic acid,3,5-dicaffeylquinic acid and 4,5-dicaffeylquinic,whose content was 6.88,19.90 and 1.50 mg/g respectively. Enzyme inhibition kinetics test showed that all the three chlorogenic acid had strong inhibitory effects onα-amylase. The inhibitory effects onα-amylase between theSteviarebaudianahairy roots extracts and the mixture which contains three chlorogenic acid standard products according to the proportion of total chlorogenic acid extracts had no significant difference.The results above indicated that the chlorogenic acids of stevia hairy roots demonstrated the excellent inhibitory effect ofα-amylase,and the main active components were chlorogenic acid,3,5-dicaffeylquinic acid and 4,5-dicaffeoylquinic acid which were expected to developing into a natural,efficient postprandial blood glucose inhibitors.

Steviarebaudiana;hairy root;chlorogenic acids;alpha amylase inhibitor

2016-08-30

盧桃(1993-)，女，碩士研究生，主要從事食品科學方面的研究，E-mail:18779883251@163.com。

*通訊作者:尹忠平(1971-)，男，講師，主要從事天然產物方面的研究，E-mail:yin_zhongping@163.com。

國家自然科學基金項目(31260368，31460436)；江西省教育廳項目(GJJ14314)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)08-0161-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.023