分散液液微萃取-高效液相色譜聯用測定水樣中的氟喹諾酮類藥物

王振忠,湯尚文,樊 靚,*

(1.湖北醫藥學院藥學院,湖北十堰 420000; 2.湖北省藥用植物綜合利用工程技術研究中心,湖北十堰 420000; 3.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室,湖北十堰 420000; 4.湖北文理學院化學與食品科學學院,湖北襄陽 441053)

分散液液微萃取-高效液相色譜聯用測定水樣中的氟喹諾酮類藥物

王振忠1,2,3,湯尚文4,樊 靚1,2,3,*

(1.湖北醫藥學院藥學院,湖北十堰 420000; 2.湖北省藥用植物綜合利用工程技術研究中心,湖北十堰 420000; 3.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室,湖北十堰 420000; 4.湖北文理學院化學與食品科學學院,湖北襄陽 441053)

建立了一種分散液液微萃取-高效液相色譜聯用測定水樣中6種氟喹諾酮類藥物的方法,采用萃取劑萃取后經氮氣吹干再用微量流動相復溶的進樣方式,考察了影響萃取效率的因素,包括萃取劑和分散劑的種類、用量、樣品pH。結果表明,以500 μL三氯甲烷為萃取劑,800 μL乙腈為分散劑,調節萃取體系pH為7時,6種氟喹諾酮藥物的富集倍數最高可達245倍,檢出限為0.075～0.34 μg/L。在漢江水、魚塘水、自來水中的加標回收率為88.6%～109.3%,相對標準偏差不高于5.8%。該方法基質效應小,富集倍數高,并且改善了傳統DLLME萃取后的萃取劑直接進樣色譜峰變形的缺點。應用于水樣中殘留氟喹諾酮類藥物的檢測,靈敏度高、簡便、準確。

氟喹諾酮類藥物,高效液相色譜,分散液液微萃取,水樣

氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones,FQs)是一類人工合成的重要廣譜抗菌劑,被廣泛用于治療人類及動物的多種感染性疾病[1]。人類和動物攝入的FQs藥物通常都會經尿液排泄及農作物施肥進入環境水域[2]。由于FQs具有很強的耐微生物降解能力,長期飲用含FQs的水會使人的致病菌產生耐藥性,對疾病的療效降低甚至失效[3-4],故環境水域中的FQs對生態系統及人類飲水安全有潛在危害。為了研究水樣中的FQs對人類健康和環境生態的影響,有必要建立一種水樣中FQs的測定方法。

水樣中的FQs多處于痕量水平,基質復雜,需要分離富集后再測定[5]。分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)是2006年由Assadi[6]等提出的一種新型少溶劑的樣品前處理技術,是一種極具應用潛力的樣品前處理方法,廣泛應用于環境分析中[7-9]。但是該方法萃取后若直接進樣,由于選用的萃取劑和流動相的相容性有限,容易導致色譜峰變形,檢測靈敏度降低。

本實驗應用DLLME技術,使用密度比水大的三氯甲烷為萃取劑,在萃取后將萃取劑全部抽出,經N2吹干后用微量流動相復溶濃縮,和高效液相色譜聯用,測定了實際水樣中的6種FQs。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六種氟喹諾酮類藥物：司帕沙星(Sparfloxacin,Spa)、氧氟沙星(Ofloxacin,Ofl)、依諾沙星(Enoxacin,Eno)、洛美沙星(Lomfloxacin,Lom)、加替沙星(Gatifloxacin,Gat)、環丙沙星(Ciprofloxacin,Cip) 美國Sigma公司,純度均大于98%,用25 mmol/L磷酸配成2 mg/mL標準儲備液,所有樣品溶液均避光保存于4 ℃的冰箱中;無水磷酸氫二鈉、磷酸、三乙胺、乙醇、甲醇、溴苯、四氯化碳、三氯甲烷、氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司,分析純;乙腈 美國Fisher Scientific公司,色譜純。

LC-20AT高效液相色譜儀 配置紫外可變波長檢測器與自動進樣器,日本島津公司;Phenenomenex Tc-C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm) 美國菲羅門公司;Millipore Simplicity 185超純水機 美國默克密理博公司;XYJ80-1離心機 金壇恒豐儀器廠;HYQ-2110渦旋混勻器 南京暢翔儀器設備有限責任公司;100 μL微量進樣器 上海高鴿工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 在15 mL具塞玻璃離心管中加入10.0 mL FQs混合標準溶液,再加入1 mL 0.025 mol/L磷酸氫二鈉(pH=7)、800 μL乙腈(分散劑)、500 μL三氯甲烷(萃取劑)。振蕩2 min,使管內形成均勻的乳濁液體系,以3000 r/min轉速離心3 min,有機相沉降到離心管底部。將離心管底部的萃取劑全部抽取至0.5 mL的離心管中,N2吹干后,沿管壁加入25 μL流動相復溶,渦旋均勻。用微量進樣器吸取20 μL進樣分析。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:phenenomenex Tc-C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流動相:V乙腈∶V(0.5%三乙胺、pH=2.5)=17∶83(流動相經過0.45 μm微孔濾膜過濾和超聲脫氣處理);流速1.0 mL/min;檢測波長280 nm;柱溫30 ℃。

1.2.3 萃取劑種類的選擇 DLLME使用的萃取劑密度需比水大,以便于后續的離心分相,還需要對分析物有良好的萃取能力。基于上述特點,分別考察二氯化碳、三氯甲烷、四氯化碳、溴苯這四種萃取劑對FQs的萃取效果。萃取劑的用量是200 μL,乙腈做分散劑,用量是800 μL,萃取體系pH=7,其它條件同1.2.1所示。

1.2.4 萃取劑的用量 以三氯甲烷為萃取劑,分別選擇150、200、250、400、500、700 μL六種不同體積,考察不同的萃取劑用量對FQs萃取效率的影響。乙腈做分散劑,用量是800 μL,萃取體系pH=7,其它條件同1.2.1所示。

1.2.5 分散劑種類的選擇 以三氯甲烷為萃取劑,用量為500 μL,選擇甲醇、丙酮、乙腈、乙醇四種分散劑,考察分散劑種類在DLLME中對FQs萃取體系的分散效果。分散劑的用量是800 μL,萃取體系pH=7。其它條件同1.2.1所示。

1.2.6 分散劑的用量 以三氯甲烷為萃取劑,用量為500 μL,乙腈為分散劑,分別選擇200、400、600、800、1000、1200 μL六種水平,考察不同的分散劑用量對FQs萃取效率的影響。萃取體系pH=7,其它條件同1.2.1所示。

1.2.7 pH的影響 以三氯甲烷為萃取劑,用量為500 μL,乙腈為分散劑,用量為800 μL。以不同pH的磷酸氫二鈉溶液調節DLLME萃取體系的pH,考察在pH=6～9范圍內FQ的萃取效果。其它條件同1.2.1所示。

1.2.8 方法學考察 配制系列標準溶液,考察方法的線性范圍;檢出限(LOD)按S/N=3計算;對200 μg/L的FQs標準溶液在日內和日間分別平行測定6次,考察方法重現性。以分析物被萃取前后色譜峰相對面積之比計算富集倍數。

1.2.9 實際樣品測定 漢江水、魚塘水及自來水經0.45 μm濾膜過濾后,各取10 mL置于15 mL具塞玻璃離心管中,各加入低濃度、高濃度兩個水平標準FQs溶液,再按1.2.1所述方法進行處理,計算加標回收率及FQs實際含量。色譜分析數據以漢江水加高濃度水平FQs溶液萃取分析為例。

1.2.10 數據處理 考察萃取劑、分散劑的種類與用量、pH等因素,將萃取后由HPLC測得的6種FQs峰面積及各因素水平導入Origin 8.5軟件,制作折線圖或柱形圖,用于直觀比較各因素水平對萃取效果的影響。

2 結果與分析

2.1 DLLME的建立

DLLME使用的萃取劑需要對分析物有良好的親和性,且有良好的色譜行為。在對FQs萃取條件考察的過程中,發現采用三氯甲烷做萃取劑,萃取完成后直接進液相色譜儀分析,色譜峰嚴重變形,影響了檢測靈敏度。

因此,本實驗在DLLME后將萃取劑全部抽出,經N2吹干后用微量流動相復溶濃縮,和HPLC聯用,測定實際水樣中的六種FQs,較好地改善了色譜峰形,提高了檢測靈敏度。

2.2 萃取條件的考察

2.2.1 萃取劑的選擇 經初步實驗,在選定色譜條件下,二氯化碳與分散劑混合后,液滴損失嚴重。在同等條件下,萃取完成后將萃取劑全部抽出經N2吹干加入25 μL流動相復溶后,三氯甲烷做萃取劑可以獲得最高的萃取效果(圖1)。本實驗最后選擇三氯甲烷作為萃取劑。

圖1 萃取劑種類的選擇Fig.1 Optimization of the type of extractant

2.2.2 萃取劑用量的影響 在同等條件下,三氯甲烷用量在150～700 μL范圍內,萃取效率隨著萃取劑用量的增加而增加(圖2)。原因是隨著三氯甲烷用量的增大,進入有機相的分析物越來越多,但是隨著三氯甲烷用量越大,N2吹干耗用時間越長,復溶時流動相沿管壁加入后,渦旋溶解均勻難度增大。綜合以上原因,實驗選用三氯甲烷用量為500 μL。

圖2 萃取劑用量的影響Fig.2 Optimization of the extractant volume

2.2.3 分散劑的選擇 分散劑的種類是影響萃取效率的另一關鍵因素,分散劑的極性應介于水和有機相之間,且能與萃取劑和水互溶。這樣可以使萃取劑在水相中分散成細小的液滴,形成水/分散劑/萃取劑的乳濁液體系。結果表明,丙酮的溶劑峰過大,對分析物的干擾嚴重;甲醇、乙腈、乙醇可以很好地將三氯甲烷分散,色譜行為良好,不干擾測定。如圖3所示,乙腈做分散劑時,萃取效果最好,且和流動相匹配,故實驗選用乙腈做分散劑。

圖3 分散劑種類的選擇Fig.3 Optimization of the type of dispersant

2.2.4 分散劑用量的影響 分散劑用量直接影響乳濁液體系的形成,影響萃取劑在水中的分散程度,從而影響萃取效率(圖4)。分散劑用量過少,不能很好的形成乳濁液,萃取效率低;用量過大,則會降低分析物在萃取劑中的分配系數,降低萃取效率。乙腈用量在800 μL時萃取效率最高,故分散劑用量選用800 μL。

圖4 分散劑用量的影響Fig.4 Optimization of the dispersant volume

2.2.5 pH的影響 FQ結構上有羧基和哌嗪基,溶液的pH不同,其分子中氨基和羧基的帶電情況不同,可以成正離子、負離子和中性分子[10]。當FQ以中性分子狀態存在時,其在有機相中的分配系數提高,萃取效率增大。顯然,pH對FQ的萃取效果有一定的影響。如圖5所示,當pH=7時,大多數的FQs以中性分子的形式存在,且與三氯甲烷萃取劑的分配系數最高,從而表現高的萃取效率。實驗選用樣品溶液的pH為7。

圖5 酸度的影響Fig.5 Optimization of pH

2.3 線性范圍、檢出限、精密度、富集倍數

線性范圍、檢出限、方法重現性(RSD)、富集倍數結果見表1。與常規的分散液液微萃取法(DLLME)[5]、聚合物整體柱微萃取(PMME)[11]、固相萃取法(SPE)[12]、離子液體液相微萃取法(I-LLME)[13]法比較了有關分析靈敏度。由于本方法經過了N2吹干再復溶濃縮的過程,靈敏度高是其顯著優點,尤其是氧氟沙星的檢出限為0.075 μg/L,遠低于其他幾種方法,司帕沙星雖然有較高的富集倍數,但是由于其出峰時間較晚,峰形展寬較嚴重,導致其檢出限相對其他FQs略高。

表1 6種FQs的線性方程、檢出限、精密度和富集倍數Table 1 Linear equation,limit of detection,RSD and enrichment factor for six FQs

注:A:PMME法;B:DLLME法;C:I-LLME法;D:SPE法。

表2 樣品測定結果Table 2 Analytical results of samples

注:ND:未檢出。

2.4 實際樣品測定

漢江水的加標色譜圖見圖6。

圖6 樣品測定色譜圖Fig.6 Chromatograms of sample determination注:漢江水加標(200 μg/L)。

為了考察樣品基質對測定的影響,做了兩個濃度水平的加標回收實驗,結果見表2。實際樣品的加標回收率在88.6%～109.3%之間,表明樣品基質對分散萃取并無顯著影響。魚塘水中檢出2種FQs的原因是由于其作為獸藥類抗生素在使用,而漢江水中僅檢測到一種FQs抗生素,且濃度遠遠低于魚塘水,說明漢江水系由于流動性強、面積大,有利于稀釋進入漢江水系的FQs。

3 結論

建立了一種DLLME-HPLC同時測定水樣中6種FQs的方法。該方法對6種FQs加標回收率可達88.6%～109.3%,檢出限可達0.075～0.34 μg/L,相對標準偏差不高于5.8%。采用在萃取結束后將萃取劑全部抽出,N2吹干后再用微量的流動相復溶濃縮后進行測定,改善了常規DLLME萃取劑后直接進樣和流動相不相容導致色譜峰變形、靈敏度降低的缺點,具有靈敏度高、簡便、準確、環境友好等特點,在水樣中FQs藥物分析中有一定的推廣應用價值。

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Determination of fluoroquinolones in water with dispersive liquid-liquid phase microextraction-HPLC

WANG Zhen-zhong1,2,3，TANG Shang-wen4，FAN Jing1,2,3,*

(1.Pharmacy College of Hubei University of Medicine,Shiyan 420000,China； 2.Engineering Research Center for Herbal Utilization of Hubei Province,Shiyan 420000,China； 3.Key Lab of Wudang Characteristic Herbal Study in Hubei Province,Shiyan 420000,China； 4.Chemistry and Food College of Hubei University of Arts and Science,Xiangyang 441053,China)

Dispersive liquid-liquid micro-extraction coupled with high performance liquid chromatography(DLLME-HPLC)was applied to separate and determine six fluoroquinolones(FQs)in aqueous samples. Before injection into HPLC,the extraction solvent droplet obtained after centrifugation was pulled out,and then dried by nitrogen flow,re-dissolved with dozens of microliters mobile phase at last. Some important parameters,like variety and dosage of extractant and dispersive solvent and pH of extraction solution,which influent the extraction efficiency were investigated. The results showed that after adding 500 μL trichloromethane as extractant solvent,800 μL acetonitrile as dispersive solvent into extraction system which pH was tuned to 7,enrichment factor of 6 FQs was up to 245 and a good linear relationship was obtained in the range of 0.075～0.34 μg/L. The recoveries of 6 FQs in 3 kinds of water from han river,fishpond and running water fell in the range from 88.6% to 109.3% and the relative standard deviation was less than 5.8%. The method had low matrix effect,high enrichment factor and avoids chromatographic peak deformation when direct injection of extraction solvent droplet in the traditional DLLME. It was proven to be sensitive,simple,and accurate in residue analysis of FQs in water.

fluoroquinolones;HPLC;DLLME;water samples

2016-09-02

王振忠(1982-)，男，博士，講師，研究方向：液相色譜分析方法，E-mail：shilywzz@163.com。

*通訊作者:樊靚(1981-)，女，博士，講師，研究方向：新型分析檢測方法開發，E-mail：zone125@163.com。

湖北省教育廳項目(B2016142);十堰市科技局項目(16Y04，16Y05);湖北省“三區”人才支持計劃；湖北醫藥學院創新團隊項目(FDFR201602)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)08-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.001