p38MAPK信號通路調控IL—6、HIF—1α及VEGF對慢性鼻—鼻竇炎發病機制的影響

范雋++++++趙昌敏++++++劉兆芳++++++胡文婷++++++逄明杰

[摘要]目的 觀察p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）在慢性鼻-鼻竇炎（CRS）不伴鼻息肉（CRSsNP）、CRS伴鼻息肉（CRSwNP）以及正常鉤突黏膜組織中表達程度的差異以及不同類型的CRS中細胞因子白介素6（IL-6）、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，探討并分析p38MAPK信號通路在CRS中可能的作用機制。方法 選取2015年7 月～2016年7月青島市市立醫院耳鼻喉科行鼻內鏡手術患者，32例CRSsNP患者竇口組織、30例CRSwNP患者鼻息肉組織和24例正常鉤突黏膜組織，分別采用蛋白質印跡法（Western Blot）檢測p38MAPK在三組中的蛋白表達量、用逆轉錄聚合酶鏈式反應法（RT-PCR）檢測IL-6、HIF-1α 和VEGF在三組中的信使核糖核酸（mRNA）的表達水平。結果 p38MAPK在CRSsNP、CRSwNP中的表達均高于正常黏膜組織，而兩組實驗組間的表達差異無統計學意義（P=0.143）；IL-6在CRSsNP、CRSwNP中的表達均高于正常黏膜組織，而兩組實驗組間的表達差異無統計學意義（P=0.082）；HIF-1α 和VEGF在CRSwNP中表達均明顯高于正常組織（P<0.05），而VEGF在CRSsNP組織和正常組織中的表達差異無統計學意義（P=0.075）。結論 p38MAPK在CRSsNP和CRSwNP中呈現出與炎性因子IL-6不同的相關性；IL-6在CRSsNP和CRSwNP中表達優勢不同，在CRSsNP組織中表達量更顯著，與其關系更密切；HIF-1a及VEGF在CRSwNP組織中同時呈高表達，可能與息肉的產生相關。

[關鍵詞]p38絲裂原激活的蛋白激酶；白細胞介素-6；缺氧誘導因子1α；血管內皮生長因子；慢性鼻-鼻竇炎

[中圖分類號] R765.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）03（c）-0008-05

[Abstract]Objective To observe the difference of the degree of expression of p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK） in chronic rhinosinusitis （CRS） without nasal polyps （CRSsNP），CRS with nasal polyps （CRSwNP） and normal uncinate process，and the expression of interleukin-6 （IL-6），hypoxia-inducible factor 1 alpha （HIF-1α ） and vascular endothelial growth factors （VEGF） in different types of CRS.And explore the possible mechanism of p38MAPK signaling pathway in CRS.Methods Patients with nasal endoscopic surgery in department of otolaryngology of Qingdao Municipal Hospital were selected from July 2015 to July 2016 in Qingdao municipal hospital otolaryngology.32 cases of patients with CRSsNP sinus tissue，30 cases of CRSwNP patients with nasal polyps and 24 cases of with normal uncinate mucosa were selected for the study.The protein expression of p38 MAPK in three groups was detected by Western blotting.And the mRNA expression levels of IL-6， HIF-1α and VEGF in three groups were detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction （RT-PCR）.Results The expression of p38MAPK in CRSsNP and CRSwNP was higher than that in normal mucosa， but there was no significant difference between the two groups （P=0.143）.The expression of IL-6 in CRSsNP and CRSwNP was higher than that in normal mucosa，but there was no significant difference between two groups （P=0.082）.The expression of HIF-1α and VEGF in CRSwNP was significantly higher than that in normal tissues （P<0.05）.While there was no significant difference in the expression of VEGF in CRSsNP and normal tissues （P=0.075）.Conclusion p38 MAPK in CRSsNP and CRSwNP shows a different correlation with inflammatory factor IL-6，and the advantage of the expression of IL-6 in CRSsNP and CRSwNP is different，and the expression of IL-6 in CRSsNP is more significant and more closely related.HIF-1a and VEGF are also highly expressed in CRSwNP tissues，which may be related to the production of polyps.

[Key words]p38 mitogen-activated protein kinase；Interleukin-6；Hypoxia-inducible factor 1 alpha；Vascular endothelial growth factor；Chronic rhinosinusitis

慢性鼻-鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是鼻竇及鼻腔的慢性炎性疾病。其特點是病程較長，反復發作，經久難愈。常見臨床癥狀有流膿涕、鼻塞、嗅覺障礙，甚至頭痛等[1-2]。據2012年昆明標準[3]，CRS分為兩種類型：①CRS不伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP）；②CRS伴有鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）。炎癥產生離不開炎性因子的激活、誘導。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通過三級激酶模式依次激活后，共同調節細胞的生長、分化、炎癥反應等，在信號轉導過程中發揮重要作用。p38MAPK是第1個被證實的作為抗炎藥物的靶向目標，對前炎癥細胞因子，如白介素6（interleukin-6，IL-6）起重要調節作用。而血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是由于缺氧誘導因子-1α （hypoxia inducible factor-1-alpha，HIF-1α）的高表達誘導產生的[4]，同時又加重炎癥及息肉的形成[5-6]。本課題組前期研究表明[7]，p38MAPK信號通路能夠對變應性超敏反應及炎性反應進行調節，但在CRSsNP及CRSwNP的不同炎性反應中，p38MAPK是否對IL- 6、HIF-1α和VEGF具有調節作用以及調節表達的差異性尚不清楚。本研究擬探討在不同類型CRS患者炎性組織中，P38MAPK是否對上述細胞因子起調控作用，通過各自表達的差異性，進一步闡明CRS的發病機制。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究通過我院醫學倫理委員會批準，受試者在術前同意參與本次研究并簽署知情同意書，所有受試對象均來源于2015年7 月～2016年7月青島市市立醫院耳鼻喉科行鼻內鏡手術患者，按照慢性鼻竇炎診療評定標準（昆明標準）[2]，受試者均無變應性鼻炎、支氣管哮喘、阿司匹林耐受不良和其他系統嚴重疾患。典型鼻竇炎癥狀持續≥12周，術前1個月內未行激素和抗組胺藥物治療。實驗共分為3組，CRSsNP組32例，其中男15例，女17例；平均年齡（41.00±17.39）歲；鼻內鏡檢查無息肉形成，副鼻竇CT示竇腔有軟組織密度影，取竇口黏膜組織。CRSwNP組30例，男17例，女13例；平均年齡（39.00±19.45）歲；鼻內鏡檢查有息肉形成，術后經病理證實為黏膜息肉，取息肉組織；對照組24例，男14例，女10例；平均年齡（33.00±13.09）歲；鼻竇CT示竇腔無軟組織影，中鼻道無贅生物，取單純鼻中隔偏曲矯正術中的正常鉤突黏膜組織。所有組織標本取出后經PBS液（上海碧云天生物技術公司）清洗后一部分置于RNA保存液（北京天根生化科技有限公司）用于mRNA的提取及RT-PCR的分析，一部分置于-80℃超低溫冰箱（青島海爾集團）中保存用于Western blot檢測蛋白含量。

1.2研究方法

1.2.1 RT-PCR檢測細胞內IL-6、HIF-1α和VEGF mRNA表達量 根據動物組織總RNA提取試劑盒說明書（北京天根生化科技公司）提取細胞總RNA，從總RNA提取出2 μg，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書（北京天根生化科技有限公司）合成cDNA第一鏈，進行gDNA去除反應，逆反應體系1為：5×g DNA Buffer 2 μl，Total RNA 500 ng，RNase-Free ddH2O 補足至10 μl；反應結束后于42℃水浴孵育3 min。在冰上進行逆轉錄反應2，反應體系為：10×Fast RT Buffer 2 μl，RT Enzyme Mix 1 μl，FQ-RT Primer Mix 2 μl，RNase-Free ddH2O 補足至10 μl，將體系2轉移至已孵育完成的體系1中，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，冰浴5 min，得到cDNA。經PCR儀（賽默飛世爾科技）進行PCR擴增，引物及GAPDH（北京天根生化科技公司）序列如表1。配制1.5%瓊脂糖（西班牙進口）凝膠電泳，凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）下觀察條帶照相，Image J圖像分析軟件分析電泳條帶灰度值，各組與GAPDH灰度值比表示該組mRNA相對表達量。

1.2.2 Western blot檢測細胞核內p-p38蛋白表達量 根據細胞核蛋白質提取試劑盒說明書（上海生工生物工程公司）提取細胞核蛋白，BCA蛋白定量方法測定細胞核濃度，配制SDS-PAGE凝膠（上海碧云天生物公司），上電泳儀（美國BIO-RAD公司）行凝膠電泳分離蛋白質，轉膜，封閉1 h，加入稀釋度為1∶500的p-p38兔抗人單克隆抗體及稀釋度為1∶500的p38兔抗人單克隆抗體（美國Millipore公司）孵育。回收一抗后，加入HRP（美國Millipore公司）標記稀釋濃度為1∶1000的二抗鼠抗兔IgG多克隆抗體（美國Millipore公司）孵育，TBST液洗滌，ELC顯色。掃描儀（賽默飛世爾科技）掃描，用Image J分析軟件分析蛋白條帶灰度值，以各組與總p38的蛋白條帶灰度值比值表示p-p38蛋白相對活化水平。

1.3 統計學方法

所得數據輸入SPSS 19.0軟件進行統計學處理，計量資料用單因素方差（one-way ANOVA）分析，差異有統計學意義，滿足方差齊性，采用Tukey檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 IL-6、HIF-1α和VEGF mRNA的表達

CRSsNP組、CRSwNP組和對照組中的IL-6、HIF-1α和VEGF mRNA表達量見表2。IL-6 mRNA在CRSsNP組、CRSwNP組中的表達量高于對照組，而兩組實驗組中的表達差異無統計學意義（F=64.73，P=0.082）（圖1-a）；HIF-1α mRNA的表達量在CRSsNP組、CRSwNP組明顯高于對照組，三組之間比較，差異均有統計學意義（F=256.39，P<0.05）（圖1-b）；VEGF mRNA的表達量在CRSwNP組明顯高于CRSsNP組和對照組，但CRSsNP組中的表達與對照組差異無統計學意義（F=58.95，P=0.075）（圖1-c）。

2.2 p38MAPK蛋白表達水平

總p38及磷酸化p38凝膠電泳結果如圖2。磷酸化p38在CRSsNP組、CRSwNP組以及對照組灰度的相對值分別為：0.6641±0.0461，0.7464±0.0914，0.2816±0.04002。三組比較，差異有統計學意義（F=76.32，P<0.05）。CRSsNP組與CRSwNP組比較，差異無統計學意義（P=0.143）；兩組實驗組與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2）。

3討論

炎性細胞的刺激分泌是CRS的反復發作的主要原因之一，而刺激炎癥細胞分泌是多種因素共同作用的結果，其中一種就是p38MAPK信號通路的激活。p38MAPK信號通路在未受刺激時主要分布于胞漿中，胞核區很少分布，經三級酶促級聯反應后形成磷酸化p38，可進入細胞核中傳遞信息，進而作用于多種其他轉錄因子[8]，促進促炎因子的產生[9]。曾有研究表明：p38MAPK信號通路對鼻息肉的發生發展可能有一定的耦聯作用[10]，本次研究中，p-p38MAPK在CRSwNP中的高表達也證實了此說法。但同時在本研究中，CRSsNP與CRSwNP中p-p38MAPK的蛋白含量無明顯差異，IL-6在兩者中的表達也無明顯差異，可推斷，炎癥的發生與p38MAPK及IL-6均有關。IL-6通過局部炎癥微環境調控，在鼻黏膜炎性反應過程中起重要作用[11]，當鼻腔的炎癥細胞受某種因素刺激后，以自分泌或旁分泌形成產生，并作用于產生細胞自身，加重機體炎性反應[12-13]。

在臨床上，CRSsNP患者黏膜組織充血水腫，淋巴細胞和漿細胞彌漫浸潤，炎性因子分泌，纖維組織增生致使血管堵塞，從而腺體萎縮，故表現為下鼻甲萎縮而中鼻甲反而明顯水腫，中鼻道變狹窄，鼻腔通氣較差。而鼻通氣障礙使鼻腔局部氧含量的降低，形成缺氧狀態，誘導缺氧因子的分泌，尤其是轉錄因子HIF-1α的分泌，又促進了VEGF生成血管，為缺氧組織提供血供，水腫的黏膜組織呈息肉樣變。VEGF 作為最強有力的血管通透因子，具有增加微血管通透性的功能，在體內可誘導血管的發生[14]。本研究中，CRSwNP患者息肉組織中的HIF-1α和 VEGF mRNA均呈高表達，這是因為當鼻腔狹窄，局部氧濃度降低，鼻黏膜細胞相互連接為“擬態血管”[15]，能為息肉早期供氧及促進生長速度。國內外研究證實，在低氧或缺血條件下，HIF-1α能增加 VEGF mRNA 的轉錄，缺血或缺氧組織可以通過釋放旁分泌因子或調節轉錄后機制上調 VEGF 受體的表達，從而啟動血管新生[16]。低氧可以誘導mRNA 編碼 VEGF 穩定性增加[17]。缺乏 HIF-1α的表達，VEGF mRNA 水平顯著降低，即使在低氧條件下，VEGF mRNA 也未被誘導表達[18]。

綜上所述，當鼻腔受到外界炎性反應刺激時，p38MAPK活化形成p-p38MAPK，誘導炎性因子IL-6的高表達。鼻黏膜炎癥持續發展，沒有得到有效控制時，促炎癥細胞因子如IL-1、IL-6和TNF等在維持炎癥過程中起了重要作用，又由于解剖結構的差異性以及鼻黏膜水腫持續存在，鼻腔通氣引流較差，又誘導了缺氧因子HIF-1α在巨噬細胞的高表達，而VEGF對毛細血管和小靜脈的特異性通透性，使血管通透性增加，使大分子物質易于穿透血管壁，導致血漿外滲，細胞外液增多，使組織發生水腫。水腫鼻黏膜組織的上皮層不斷增殖增厚，逐漸形成生長性組織即鼻息肉，又反過來刺激VEGF的分泌來提供血管[19]。

但是，有關CRS不同類型患者組織中IL-6表達的結果并不一致，如肖志超[20]的研究顯示，IL-6在單純CRS患者及CRSwNP患者黏膜中的表達量無明顯差異性。在黃正華等[21]的研究中HIF-1α mRNA與VEGF mRNA 的表達水平在鼻息肉組與對照組中無明顯差異性。不同結果的產生可能是由于實驗方法不同，也可能由于病情差異而表現不同，因此還有待進一步研究和證實。同時，研究p38MAPK信號通路對IL-6、HIF-1α與VEGF的影響及其相互關系，也在難治性CRS復發的控制與治療中有一定的臨床意義。

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