激光捕獲顯微切割技術結合iTRAQ標記定量蛋白質組在結腸癌篩查中的應用研究

穆儀冰+張桂英

[摘要] 目的 采用激光捕獲顯微切割技術（LCM）結合iTRAQ標記定量蛋白質組技術，篩查結腸癌間質的差異表達蛋白質。 方法 ①選擇12對結腸腺癌標本為觀察組，其配對正常結腸黏膜（與結腸癌標本至少相距10 cm以上）為對照組，采用LCM技術分別純化其間質作為生物樣本；② iTRAQ標記定量蛋白質組技術鑒定兩組間的差異表達蛋白質；③采用Geneontology生物信息學軟件（http：//pantherdb.org/）對差異表達蛋白質進行細胞成分、生物學途徑和分子功能分析。 結果 ①鑒定了70個差異表達蛋白，其中37個蛋白在結腸癌間質中高表達，33個蛋白在結腸癌間質中表達降低；②從生物學途徑、細胞成分、分子功能三個方面對差異表達蛋白質進行分析。 結論 ①首次采用iTRAQ標記定量蛋白質組學和LCM結合的方法篩查結腸癌間質差異表達蛋白質；②GO功能分析顯示了差異表達蛋白質的細胞成分、分子功能以及生物學功能。

[關鍵詞] 結腸癌；間質；激光捕獲顯微切割；iTRAQ標記定量蛋白組學；生物信息學

[中圖分類號] R735 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（c）-0026-05

The application of LCM combined with iTRAQ quantitative proteomic technology in colon cancer

MU Yibing1 ZHANG Guiying2

1. Department of Gastroenterology， the fourth hospital of Changsha， Hunan Province， Changsha 410008， China； 2. Department of Gastroenterology， Xiangya Hospital Central South University， Hunan Province， Changsha 410008， China

[Abstract] Objective To search differentially expressed proteins in colon cancer stroma （CS） by laser capture microdissection （LCM） combined with iTRAQ marker quantitative proteomic technique. Methods ①12 CS and adenocarcinoma tissues were selected as observation group， and normal mucosa （>10 cm away from adenocarcinoma） was selected as control group， the tissues were separated by LCM. ②iTRAQ quantitative proteomic technology was used to identified differentially expressed proteins（DEPs）.③ GENEONTOLOGY functional annotation（GO） was used for bioinformatics analysis （Cellular components， biological pathways and molecular functional analysis）. Results ①70 DEPs were identified in CS （37 upregulated and 33 downregulated）. ②The differentially expressed proteins were analyzed from three aspects： biological pathway， cell composition and molecular functio. Conclusion ① For the first time， 70 DEPs in CS by LCM and iTRAQ quantitative proteomic technology are identified. ② GO can be used to analysis the biology function of the 70 DEPs and provided important values to the pathology of colon cancer.

[Key words] Colon cancer； Stromal； Laser capturemicrodissection； iTRAQ-based quantitative proteomics； Bioinformatics analysis

腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到重視，現(xiàn)已成為當今腫瘤研究的一個熱門話題。結腸癌是世界常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率位居歐美發(fā)達國家的第三位[1-2]。近年來，由于環(huán)境的惡化和飲食結構的調整，我國結腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，嚴重危害了人民的生命和健康。目前，國內外對于結腸癌的研究多集中在結腸癌的癌細胞本身，但對于結腸癌微環(huán)境的研究較少。

本研究從腫瘤微環(huán)境的角度出發(fā)，對比研究結腸癌間質和正常結腸黏膜間質蛋白質表達譜的差異，首次采用激光捕獲顯微切割技術（laser capturemicrodissection，LCM）聯(lián)合iTRAQ標記定量蛋白組學技術篩選結腸癌間質差異表達蛋白質。從蛋白質水平探討結腸癌間質在腫瘤惡性化進程中的作用，初步探索結腸癌微環(huán)境所獨有的特征，為尋找結腸癌診斷及治療標志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 試劑：甲基綠、蛋白酶抑制劑、OCT組織包埋劑、十二烷基磺酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、苯三氟乙酸（TFA）、胰蛋白酶、iTRAQ試劑（118，121），SCX強陽離子交換柱（Luna SCX 100A）、strata-X C18除鹽柱。

儀器：Beckman L765超速離心機、徠卡CM1900冰凍切割機、激光捕獲顯微切割系統(tǒng)、CTR6000激光捕獲顯微切割儀、高效液相色譜儀（日本島津公司）、microTOF-Q II質譜、UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF基質輔助激光解析飛行時間質譜。

1.1.2 標本采集及處理 12對結腸腺癌標本均來自中南大學湘雅醫(yī)院普外科手術切除標本；其中男7例，女5例，患者平均年齡為（48±8）歲，臨床分期按照DUKES分期分為A-D期。所有病例術前未接受放療和化療，并經(jīng)病理學專家確診。手術切除的新鮮結腸癌組織與配對結腸黏膜組織相距至少10 cm。每塊組織取材1.0 cm×1.0 cm大小。取材后，迅速將標本置于液氮速凍30 min，然后超低溫冰箱（-80℃）保存[3]。本研究經(jīng)中南大學湘雅醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，且經(jīng)過患者知情同意后進行。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備以及1D SPS-PAGE（一向聚丙烯酰胺凝膠電泳） 冰凍組織O.C.T包埋劑包埋，在Leica CM 1900冰凍切割機下切成8 μm厚連續(xù)冰凍切片后[4]。加入組織裂解液（7 mol/L Urea，4% chaps，5 mmol/L PMSF，0.5 mmol/L EDTA，100 mmol/L DTT），充分混合，4℃裂解1 h，Ultrasound 5 min（冰上），離心（20 000 g， 25 min），取上清。上清加入DTT至終濃度10 mmol/L。56℃水浴1 h，取出后，迅速加入1 AM至終濃度55 mmol/L，暗室靜置1 h。然后加入預冷丙酮（體積為4×樣本溶液體積），沉淀3 h（-20℃），離心（20 000 g，4℃）20 min，取沉淀。然后加入復溶緩沖液300 μL，終濃度為50%TEAB，0.1%SDS。20 000 g，4℃，超聲3 min助溶，用Bradford法測定蛋白質的濃度，-80℃保存?zhèn)溆茫⑦M行一向聚丙烯酰胺凝膠電泳[4]。

1.2.2 iTRAQ標記蛋白質 118，121各標記試劑中分別加入異丙醇70 μL，充分混合均勻。在結腸癌間質或正常結腸間質中分別加入iTRAQ試劑（結腸癌間質：iTRAQTM reagent 118；正常結腸間質：iTRAQTM reagent 121），混勻，室溫下孵育2 h，每管加入100 μL超純水，終止iTRAQ標記反應，室溫下孵育30 min，將被標記的所有樣品混合混勻，冷凍干燥。然后，將各樣本進行強氧離子交換色譜（HPLC）分離、C18反相色譜除鹽。

1.2.3 質譜檢測 用microTOF-QII（Bruker.Daltonics，Germany）檢測肽段信號。質譜分析采用信息依賴性獲取模式（information dependent acquisition mode，IDA）。實驗重復3次。差異表達蛋白質篩選需同時滿足下列條件[5]：①蛋白的鑒定有兩個或兩個以上獨特肽段；②兩組間比值≥1.3或≤0.667。

1.2.4 Geneontology在線軟件進行生物信息學分析 為了對差異蛋白質的生物信息學有一個全面的認識，進行蛋白質GO分析。采用GO分析軟件GENEONTOLOGY生物信息學軟件（http：//pantherdb.org/）分別從生物學途徑（GO_BP）、細胞成分（GO_CC）和分子功能（GO_MP）3個方面注釋。

2 結果

2.1 蛋白質譜鑒定及分析

篩選到70個差異表達蛋白質（表1），其中37個蛋白在結腸癌間質中高表達，33個蛋白在腫瘤間質中表達降低。這些差異表達蛋白質所涉及的功能分類主要有細胞外基質、細胞骨架蛋白、內質網(wǎng)應激、代謝、炎性反應等。

2.1.2 生物信息學分析 本實驗中鑒定間質差異表達蛋白質共70個，從生物學途徑、細胞成分、分子功能3個方面對差異表達蛋白質進行分析。

按照分子功能注釋，47.2%的差異蛋白屬于binding蛋白，包括DNA binding、RNA binding、核酸binding、GTP binding等；30.6%具有催化活性，17.0%的蛋白具有分子結構調節(jié)活性，轉運活性蛋白占2.8%，受體活性蛋白占2.8%，可能與這些蛋白的豐度較低有關。見圖1。

按照生物學途徑分類，參與生理調節(jié)的蛋白占25.0%，參與細胞代謝的蛋白占19.7%，參與細胞合成的蛋白占17.1%，與其他細胞及組織發(fā)生相互作用的的蛋白占10.5%，參與免疫調節(jié)、應激反應等蛋白所占比例較少。見圖2。

按照細胞成分注釋，這些差異表達蛋白質中的大多數(shù)屬于細胞內蛋白，其中細胞器蛋白占27.3%，細胞膜蛋白占2.3%，細胞連接蛋白占2.3%，細胞外基質占2.3%，細胞外蛋白占11.4%。見圖3。

3 討論

腫瘤微環(huán)境，即腫瘤細胞生長和生活的內環(huán)境，它由許多間質細胞組成，包括成纖維細胞、免疫和炎性細胞、脂肪細胞、膠質細胞、平滑肌細胞以及一些血管細胞等[6]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，間質細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展的進程中起著重要的促進作用，間質細胞可以通過產(chǎn)生細胞趨化因子、生長因子和基質降解酶從而促進血管生成和基底膜破壞，使腫瘤的侵襲能力增強[7-8]。對比研究腫瘤間質細胞與正常組織間質細胞的差別，將有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境所獨有的特征。

因此，本研究首次采用LCM技術從新鮮的手術[J]. Expert Rev Anticancer Ther，2013，13（4）：439-450..

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（收稿日期：2016-11-15 本文編輯：李岳澤）