從線粒體相關凋亡蛋白表達探討溫肺降濁方對VD大鼠學習記憶能力的影響※

● 胡躍強 向軍軍 賴菁菁 汪庭龍 吳 林 唐 農▲

從線粒體相關凋亡蛋白表達探討溫肺降濁方對VD大鼠學習記憶能力的影響※

● 胡躍強1向軍軍1賴菁菁1汪庭龍2吳 林2唐 農2▲

目的：探討溫肺降濁方對血管性癡呆(VD)大鼠海馬組織Cytc、Bax蛋白表達變化及大鼠學習記憶能力的影響。方法：雄性SPF級SD大鼠120只，隨機分為假手術組、模型組、中藥組、西藥組，每組各30只。采用雙側頸總動脈永久性結扎法制作VD大鼠模型，中藥組給予溫肺降濁方灌胃，西藥組予鹽酸多奈哌齊灌胃，其余兩組則予以等量生理鹽水灌胃。采用Morris水迷宮測試大鼠學習、記憶能力，RT-PCR檢測大鼠海馬Cytc、Bax mRNA含量，Western blot檢測大鼠海馬Cytc、Bax蛋白表達水平。結果：①Morris水迷宮學習記憶能力測試結果證實與假手術組比較，模型組大鼠學習成績與記憶成績下降，各用藥組大鼠的學習成績與記憶成績均有顯著提高(P<0.05)；②與模型組比較，中藥組及西藥組大鼠海馬Cytc、Bax mRNA及蛋白表達量含量顯著下降 (P<0.05)，且藥物組之間比較無統計學意義(P>0.05)。結論：溫肺降濁方可明顯改善VD大鼠學習記憶能力，其機制可能與其抑制海馬Cytc及Bax表達有關。

溫肺降濁方 血管性癡呆 細胞凋亡 Cytc Bax

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是因腦血管病變引發腦損傷從而進一步導致癡呆的病癥，主要是以記憶、學習能力缺損為主的獲得性智力持續性損害[1]。隨著社會人口老齡化的加劇，VD 的發病率不斷升高。目前，對于VD的治療，西醫尚無特殊有效的方法，而中醫藥以其多途徑、多靶點、療效好及副作用少的特點，在VD 的治療中顯示出良好的前景。筆者發現[2]，肺臟虛損及功能失調在 VD 發病中起著重要作用，并在此基礎上提出經驗方溫肺降濁方，并在臨床上取得一定效果[3]，但其機制有待于進一步闡明。本研究通過檢測線粒體凋亡相關基因Cytc、Bax的表達，以探討其對VD大鼠學習記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SPF級SD大鼠120只，3月齡，體重200±50g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK桂2014-0002。按隨機數字表進行分成4組：假手術組、模型組、中藥組、西藥組，每組30只。

1.2 藥物制備及主要儀器試劑 ①實驗藥物：溫肺降濁方：制附子20g、黨參15g、干姜10g、酒大黃10g、田七10g、炙甘草10g共6味中藥組成，由我院藥劑科統一采購備用(每單味藥要求同一產地、同一質量層次、同一批次)(由江蘇江陰天江藥業有限公司提供，批號：1406033)的用量。鹽酸多奈哌齊片：衛材藥業有限公司制造，每片5mg。其濃度及等效劑量按體表面積折算換算，灌胃中藥為生藥濃度，藥物濃度均按0.02g/mL，按每天1mL/100g 體重灌胃。②主要試劑及儀器：總RNA提取試劑盒、PCR反應試劑盒、逆轉錄試劑盒，引物及內參(GAPDH)均由大連寶生物有限公司(TaKaRa)提供；Cytc兔抗、BAX兔抗均有美國Cell Signaling Teachnology公司；MT-200型Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 實驗模型制備及藥物干預方法 VD大鼠模型采用雙側頸總動脈永久結扎方法制備[4]，將麻醉完全的大鼠仰臥位固定大鼠于自制的鼠板上，沿著頸部中線正中切幵，鈍性分離肌肉及結締組織，分離出雙側頸總動脈并埋線，操作過程避免損傷迷走神經，用無菌絲線依次結扎雙側頸總動脈，術后第1天開始，中藥組予溫肺降濁方湯劑按濃度0.08g/mL，每天1mL/100g體重灌胃，1 次/天。西藥組予多奈哌齊溶液灌胃，其灌胃濃度0.02g/mL，按每天1mL/100g，按體重灌胃，1次/天，連續29天。模型組與假手術組均予相同劑量的生理鹽水灌胃。

1.4 指標觀察

1.4.1 學習記憶功能測定 定位航行實驗：連續5天，每組大鼠每天上下午從四個象項各訓練1次，將大鼠尋找平臺的時間設置為120s，記錄大鼠從入水到爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期，此作為大鼠空間學習能力的檢測指標。空間搜索實驗：大鼠完成定位航行實驗后，于第6天進行空間探索實驗，撤走平臺，依次將大鼠從4個象限放入水中，分別記錄其停留在平臺象限的時間及跨越原來平臺的次數作為空間記憶的檢測指標。

1.4.2 熒光定量(SYBR Green)RT-PCR檢測大鼠海馬Cytc、Bax mRNA表達 大腦組織總RNA提取：參考Trizol試劑盒說明書提取總mRNA；總RNA純度濃度測定：采用紫外分光光度法，測定其260及280nm的吸光度，并根據OD260/OD280比值評估RNA的純度；引物合成：Cytc、Bax和GAPDH引物序列如下：Bax上游5′-CGATTGGCGATGAACTGGA-3′；下游：5′- CAAACATGTCAGCTGCCACAC- 3′，產物長度為109 bp；Cyct上游：5′-GTCAGATGCCCGACACATTCA-3′；下游：5′- CTGCTTCATTCGGACCAGACAC- 3′，產物長度為80 bp；GAPDH上游5′- GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG′- 3′；下游5′- ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA -3′，產物長度143bp；④比較兩基因擴增效率：通過對照樣品、檢測樣品的目的基因及管家基因的Ct值，然后以管家基因的Ct值為依據對目的基因進行差值校正；⑤反應體系及條件：種基因同管擴增，反應體系均為20μl，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 10μl ，cDNA模板2.0μl、兩種基因上下游引物(10pmol/μl)各0.8μl、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)30.4μl，加無RNA酶的水6μl。在Appllied Blosystem7500 Real PCR System中進行擴增反應，反應條件為：94℃預變性30s，95℃5s，60.0℃34s，40個循環，4℃保存。每例樣品及陰性對照均設4個平行復孔，取均值。

1.4.3 Western blot檢測大鼠海馬組織Cytc、Bax蛋白水平 提取大鼠海馬組織蛋白，分裝保存于-20℃冰箱備用；用BCA試劑盒測定蛋白含量；蛋白上樣20μl，經電泳分離后，轉至PVADF膜上；于室溫條件下封閉1h，經TBST漂洗3次后，分別于一抗Cytc(1：1000)、Bax(1：1000)、β-actin(1：1000)4℃搖床上孵育過夜；再經TBST漂洗3次后，再加入二抗室溫下振蕩孵育1h；經漂洗后，加入ECL孵育3min，暗室進行X膠片顯影、定影；采用Image-J圖像分析軟件對條帶進行灰度分析；以目的條帶與內參β-actin的灰度比值表示Cytc、Bax蛋白表達水平。

2 結果

2.1 行為學測試

2.1.1 定位航行實驗 隨著訓練天數的增加，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短，其中假手術組最明顯，中藥組及西藥組次之；第3天與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)，第4、5天與模型組比較，中藥組與西藥組逃避潛伏期顯著下降(P<0.05)；中藥組與西藥組比較無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.1.2 空間搜索試驗 與空白組比較，模型組大鼠穿越平臺次數及在平臺象限滯留的時間顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，中藥組與西藥組穿越平臺次數及在平臺象限滯留的時間顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；中藥組與西藥組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 VD大鼠Morris水迷宮實驗測試成績比較

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.2 大鼠海馬Cytc、Bax mRNA的表達變化 與假手術組比較，模型組Cytc、Bax mRNA表達量明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，中藥組二者mRNA含量顯著下降(P<0.05)，而中藥組與西藥組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組 Cytc、Bax mRNA相對表達量比較

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.3 大鼠海馬Cytc、Bax蛋白的表達變化 與假手術組比較，模型組表達達水平明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，中藥組表達顯著下降(P<0.05)，而中藥組與西藥組比較，差異無統計學意義(P>0.05) 見表3及圖1。

表3 各組 Cytc、bax蛋白表達比較

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

圖1：各組大鼠海馬 Cytc、Bax蛋白表達變化(1：假手術組；

3 討論

目前，對于VD的治療，西醫多從某個單一環節著手如用膽堿酯酶抑制劑改善認知功能[5]。而中醫以其療效好、多靶點、副作用少的特點，越來越受到重視[6-7]，但對于準確認識疾病病因病機的是前提。目前中醫普遍認為腎虛、痰濁、瘀血是VD發生發展的主要因素，治療上仍主要采取補腎、活血、益氣、化痰等法，但臨床療效并不令人滿意[8]。而我們通過長期理論研究發現此病與肺密切相關，因而提出從肺論治，已經臨床觀察證實有較好的療效[9]。

《靈樞·天年》中記載：“肺氣衰，魄離，故言善誤”。《至真要大論》又云：“諸氣膹郁皆屬于肺。”《素問·四時逆從刺論》曰：“陽氣衰竭，令人善忘。”提示了肺氣虛衰可能是神機失用的關鍵。結合經典，我們認為肺具有“水精四布，五經并行”之功，肺失宣降則瘀濁停聚；陽主動，主溫煦，陽失溫化，必然造成經絡臟器及九竅不通，因此溫肺降濁是治療血管性癡呆的關鍵，故擬定了溫肺降濁方。方中附子補腎陽；干姜溫脾陽；黨參合干姜同補脾胃之氣；三七活血化瘀，疏通血管；大黃蕩滌瘀滯，有推陳出新之功；甘草和干姜辛甘化陽，培土生金，且能調和諸藥。全方配伍精良，以溫肺降濁陽為主，兼有化痰通絡、活血化瘀，溫中有清，先天與后天兼顧，故而能使機體吸收、分布、代謝、排泄等功能正常。多靶點的消除VD的誘發因素，起到預防和治療的雙重功效。

近來研究發現，大鼠學習記憶能力的改變與海馬CA1區凋亡細胞有很強的相關性[10]。而抑制腦神經細胞凋亡對血管性癡呆大鼠有明顯治療作用[11]。最新文獻也記載，線粒體凋亡蛋白Cytc、Bax在凋亡過程中發揮主要作用[12]。胡迪等[13]通過對紅景天苷對鎘中毒的保護作用，其機制可能減低線粒體中Cytc的釋放，降低 Bax 的表達有關。史志勤[14]等也證實了通過抑制抑制線粒體Cytc及Bax的表達，可對細胞起到顯著保護作用。本研究顯示中藥組大鼠學習記憶明顯改善，且Cytc、Bax的mRNA及蛋白的表達量下降，這與上述研究結論基本一致。

綜上所述，本研究結果提示溫肺降濁方可抑制促凋亡蛋白Cytc、Bax的表達，改善大鼠的學習記憶能力，其可能是防治血管性癡呆的作用機制之一。

[1]Lebage Gamarallage MM，Galloway S，Takechi R，et al.Probucolsuppresses enterocytic accmulation of amyloid-induced by saturatedfat and cholesterol feeding[J]. Lipids，2012，47(1)：27-34.

[2]趙清山，王清碧，唐 農，等.唐農教授從肺論治血管性癡呆的經驗[J].貴陽中醫學院學報，2014，36(1)：6-8.

[3]唐 農，胡躍強，吳 林，等.益肺宣肺降濁膠囊對血管性癡呆患者的療效及腦神經遞質的影響[J].遼寧中醫雜志，2014，41(10)：2108-2110.

[4]Zhang ZH，Shi GX，Li QQ，et al.Comparison of cognitive performance between two rat models of vascular dementia[J].The International Journal Of Neuroscience，2014，124 (11)：818-823.

[5]李 強，胡長林，王景周.地黃益知浸膏對老年性癡呆大鼠海馬磷酸化CREB、GSK-3β表達的影響[J].中國老年學雜志，2008，28(6)：539-542.

[6]徐 炎，李學軍.多靶點藥物治療及藥物發現[J].藥學學報，2009，44(3)：226-230.

[7]致公黨中央調查組.推進中醫藥事業健康發展[J].中國發展，2013，13(6)：1-6.

[8]姜 雄，況時祥.益氣升陽活血法治療血管性癡呆早期機理探討[J].時珍國醫國藥，2015，26(8)：1967-1968.

[9]唐 農，胡躍強，吳 林，等.益肺宣肺降濁膠囊治療血管性癡呆患者107例臨床觀察[J].中醫雜志，2014，55(12)：1025-1028.

[10]隋竹欣，劉 昊，王海濤，等．創傷后應激障礙大鼠海馬、杏仁核神經元自噬和凋亡改變[J].西安交通大學學報(醫學版)，2014，35(1)：136-138．

[11]馬云枝，史繼鑫，孟 闖，等．復智膠囊對血管性癡呆大鼠腦組織海馬區神經細胞凋亡的影響[J]．時珍國醫國藥，2011，22(9)：2177-2178.

[12]陳小睿，唐光曦，孟憲麗，等.通脈醒腦滴丸對線栓法致腦缺血再灌注大鼠細胞凋亡線粒體信號轉導通路的影響[J].時珍國醫國藥，2015，21(7)：1803-1804.

[13]胡 迪，劉學忠，謝俊澤，等.紅景天苷對鎘中毒的保護作用及機制研究[J].毒理學雜志，2015，29(5)：361-365.

[14]史志勤，卞紅磊，魏艷靜，等.重組人紅細胞生成素對癲癇持續狀態大鼠海馬線粒體凋亡途徑相關調控因子的影響及作用機制[J].中國全科醫學，2015，18(19)：2310-2316.

中醫文化

曹雪芹名中藏玄機

《紅樓夢》的作者是清代的曹雪芹，他有三個號：雪芹、芹圃、芹溪，都有“芹”字。這絕不是因為他江郎才盡，想不出更好的名字，而是緣于他對一種叫做“水芹”的植物的鐘愛，也因水芹治好了不少疑難病癥。

相傳曹家被抄后，曹雪芹開始了漫長的“舉家食粥酒常賒”的窮苦生活。酒館里有個年過半百的老伙計叫馬青，見曹雪芹滿腹學問，便不時地接濟他。久而久之，兩人成了推心置腹的好朋友。

有一回曹雪芹一連三天未見馬青露面，一打聽才知馬青病得不輕，便跑到馬青家看望。一進家門卻見馬青躺在炕上呻吟，見到摯友這般境況，曹雪芹心中十分難受。他走近炕前，為馬青號了號脈，隨即便跑到村頭的池塘邊，割下一把野生的水芹，熬成湯，喂馬青服下。此后三天，曹雪芹日日到馬青家中，為病友熬水芹湯。三天后，馬青竟在未服用其他藥物的情況下完全恢復了健康。

從此，曹雪芹名聲大振，前來求醫的村民絡繹不絕。他也因此就地取材，以水芹和從山中采來的草藥為主，為當地百姓治病，分文不收。為了表達自己為民治病的志向，他便自號“雪芹”，以后又起了“芹圃”“芹溪”兩個號，以表達矢志為民醫治疾病的心愿。

廣西中醫基礎理論重點實驗室系統課題(No.KJT13076)；廣西醫學高層次骨干人才“139”計劃培養人選資助項目；廣西高等學校優秀中青年骨干教師培養工程資助項目(No.JS13069)

1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院(530023)；2.廣西中醫藥大學(530023)

▲通訊作者 唐農，男，醫學博士，教授，主任醫師，博士研究生導師。長期從事中醫內科的臨床、教學、科研和管理工作。E-mail：137463195@qq.com