知母總皂苷對血管性抑郁小鼠抑郁行為和腦組織病理學的影響

龔 林，邱 彥，劉 靜，魯 毅，王亞威，段 靖，馬 靜，周 永

（1.解放軍454醫院門診部，江蘇 南京210002；2.解放軍454醫院藥劑科，江蘇 南京 210002；3.解放軍454醫院器械科，江蘇 南京 210002）

知母總皂苷對血管性抑郁小鼠抑郁行為和腦組織病理學的影響

龔 林1，邱 彥2，劉 靜2，魯 毅2，王亞威2，段 靖2，馬 靜2，周 永3

（1.解放軍454醫院門診部，江蘇 南京210002；2.解放軍454醫院藥劑科，江蘇 南京 210002；3.解放軍454醫院器械科，江蘇 南京 210002）

目的：探討知母總皂苷對血管性抑郁小鼠抑郁行為、腦組織炎癥因子及病理學的影響。方法：采用反復缺血再灌注方法制備血管性抑郁小鼠模型，灌胃給予知母總皂苷，實驗2周后，觀察血管性抑郁小鼠行為學變化，檢測小鼠腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量以及腦組織病理學改變。結果：與模型組相比，知母總皂苷中劑量組和高劑量組小鼠水平運動得分、垂直運動得分均明顯增加（P ＜ 0.05），明顯縮短小鼠懸尾、游泳不動時間（P ＜ 0.05）；與模型組比較，知母總皂苷三個劑量組均顯著抑制小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的升高（P ＜ 0.05）。腦組織病理切片顯示，與模型組相比，知母總皂苷各劑量組可顯著減輕大腦皮質錐體細胞和腦實質神經細胞出現的核固縮、核溶解、核體不規則等情況。透射電鏡結果顯示，與模型組比較，知母總皂苷各劑量組能改善腦組織神經元細胞變小、突觸泡擴張、血管周圍有空白區等現象。結論：知母總皂苷對血管性抑郁小鼠具有顯著的治療作用。

知母總皂苷；血管性抑郁；行為學；炎癥因子；病理學

血管性抑郁是抑郁常見的一種亞型，是與腦血管病或血管危險因素密切相關的一種老年期抑郁綜合征。心腦血管疾病是一種嚴重威脅人類特別是中老年人健康的常見病，發病率逐年在增加；心腦血管疾病與抑郁互為因果致病，顯著增加了患者的患病率、致殘率和死亡率，但至今對血管性抑郁的病因及機制尚不完全明確。目前，我國人口老齡化發展速度極快，而血管性抑郁則是老齡化社會面臨的一個重要的醫學和社會問題。由于血管性抑郁患者對抗抑郁劑敏感性低（療效不足50%），耐受性差，易出現毒副作用[1]，對患者及其家庭、社會造成沉重負擔，已成為國內外醫學關注的熱點。知母主要功效為清熱瀉火、滋陰潤燥、止渴除煩等，用于溫熱病、肺熱咳嗽、陰虛火旺、高熱煩渴等病癥。研究[2]表明，知母皂苷及其苷元是知母的主要活性成分，具有防止老年癡呆，保護腦缺血損傷、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、抗骨質疏松、降糖降壓、降血脂等廣泛的藥理活性；但未見知母活性成分或其中藥復方在血管性抑郁方面應用與研究的報道。本實驗通過阻斷小鼠雙側頸總動脈反復缺血再灌注方法制備血管性抑郁模型，觀察知母總皂苷（saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge.，SAaB）對血管性抑郁小鼠行為學的影響，腦組織中促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量的變化以及腦組織病理學改變，為其在抗血管性抑郁方面的開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 實驗動物

ICR小鼠，60只，雄性，體質量18 ～ 20 g，SPF級，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2013-0016，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。動物實驗室溫度22 ～ 24 ℃，濕度40% ～ 60%，光照時間隨自然變化，動物自由飲食。

1.2 藥品及試劑

知母總皂苷（由解放軍四五四醫院藥劑科提取制備），其主要成分為知母皂苷B-Ⅱ（52%），知母皂苷A-Ⅲ（7%），知母皂苷B（2%）；鹽酸氟西汀膠囊（百優解，禮來蘇州制藥有限公司，批號：9901C）。TNF-α（批號：20151110）、IL-1β（批號：20151016）、IL-6（批號：20160108）ELISA試劑盒，均購自上海星黍生物科技有限公司。

1.3 實驗儀器

酶標儀（Thermo FisherMK3型，上海賽默生物科技發展有限公司）；滑動切片機（RM2135型，德國LEICA公司）；光學顯微鏡（Olympus DM750型，日本Olympus公司）；透射電鏡（H-600型，日本日立公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

將60只小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為：假手術組、模型組、鹽酸氟西汀組（10 mg?kg-1，按0.1 mL?10 g-1小鼠體質量灌胃給藥）、低劑量組（知母總皂苷70 mg?kg-1）、中劑量組（知母總皂苷140 mg?kg-1）、高劑量組（知母總皂苷280 mg?kg-1）。知母總皂苷各劑量組按0.1 mL?10 g-1小鼠體質量灌胃給藥。假手術和模型組灌胃給予相應體積的生理鹽水。在實驗造模前給藥1周，造模后再繼續給藥1周，共給藥14 d，qd。

2.2 血管性抑郁小鼠模型的建立[3]

小鼠經腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉后，將小鼠仰臥位固定，沿頸前正中切口，鈍性分離暴露雙側頸總動脈，使用小號動脈夾阻斷雙側頸總動脈供血5 min后，打開動脈夾恢復供血10 min，再次用動脈夾阻斷供血5 min后，將動脈夾完全移開，使得其動脈恢復血流，術中密切觀察小鼠呼吸、心跳，術后縫合切口。假手術組除不阻斷供血外，其余處理方式與實驗組相同。手術后用電熱毯維持小鼠正常的體溫，直到小鼠蘇醒。于手術后7 d進行檢查測試。

2.3 行為學檢測[4-5]

2.3.1 曠場試驗 曠場為一50 cm×50 cm×50 cm正方體，底面含25個等邊方格。將小鼠放在中心方格內，觀察3 min內的水平運動和垂直運動得分。兩只動物實驗間歇徹底清潔曠場。

2.3.2 懸尾試驗 末次給藥后1 h，將小鼠尾端2 cm部位貼在一水平支撐物上，使動物成倒掛狀態，支撐物放置于一敞口箱內，其頭部離底面約5 cm。記錄小鼠6 min內后4 min的不動時間，各組小鼠平行操作。

2.3.3 強迫游泳試驗 末次給藥1次1 h后，將小鼠單獨放入高20 cm、直徑14 cm的圓柱型玻璃缸中，缸內水深10 cm，水溫23 ～ 25 ℃。從小鼠入水后記時6 min，記錄后4 min內的累計不動時間，各組小鼠平行操作。

2.4 炎癥因子含量測定[6-7]

末次檢測結束后，將小鼠麻醉放血處死，取腦組織，左側腦組織置于– 80 ℃冰箱中，待測TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

2.5 腦組織透射電鏡及病理學檢查

將小鼠麻醉放血處死，取腦組織，右側腦組織一部分切成0.5 m3大小組織，用4%多聚甲醛-0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.3 ～ 7.4）固定保存，做透射電鏡檢查；另取一部分用10%中性甲醛溶液固定，常規脫水、石蠟包埋切片、HE染色，光鏡下觀察病理學變化。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠抑郁行為的影響

在曠場試驗、懸尾試驗和強迫游泳試驗中，與假手術組比較，模型組小鼠水平運動得分、垂直運動得分顯著降低，懸尾、游泳不動時間顯著增加（P ＜ 0.05），提示小鼠出現明顯的抑郁行為，表明小鼠血管性抑郁模型造模成功。與模型組小鼠相比，知母總皂苷高劑量組和氟西汀組小鼠水平運動得分、垂直運動得分明顯增加（P ＜ 0.05），懸尾、游泳不動時間均縮短（P ＜0.05），提示知母總皂苷對反復缺血再灌注所致血管性抑郁小鼠的行為學有顯著改善作用。結果見表1、表2。

表1 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠曠場試驗的影響. n = 10Tab 1 Effect of SAaB on open field test of vascular depression mice. n = 10

表2 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠懸尾、游泳不動時間的影響. n =10Tab 2 Effect of SAaB on the immobility time in both of the tail suspension test and the forced swimming test in mice with vascular depression. n = 10

3.2 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響

與假手術組比較，模型組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯增加（P ＜ 0.01）。與模型組小鼠相比，知母總皂苷三個劑量組和氟西汀組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量均不同程度降低（P ＜ 0.05）；結果提示，知母總皂苷對血管性抑郁小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6這3種促炎性細胞因子的表達有明顯的抑制作用。詳見表3。

表3 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響. n = 10Tab 3 Effect of SAaB on TNF-α, IL-1β and IL-6 levels in brain tissue of vascular depression mice. n = 10

3.3 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠腦組織病理學的影響

光學顯微鏡下觀察結果詳見圖1，結果顯示假手術組腦組織神經元及膠質細胞正常，核膜清楚，核仁明顯，未見神經變性壞死及中性粒細胞浸潤等病理改變；模型組腦組織中神經元結構模糊，線粒體腫脹，尼氏小體減少，出現不同程度的核固縮、核溶解，核體不規則；知母總皂苷三個劑量組可減輕血管性抑郁小鼠出現的上述腦組織病理改變，可改善大腦皮質錐體細胞和腦實質神經細胞的核固縮、核溶解程度。透射電鏡超微結構觀察結果表明，假手術組腦組織結構正常，神經元細胞、突觸泡、小血管均正常；模型組神經元細胞變小，細胞核染色質邊集、畸形，血管周圍有空白區；知母總皂苷三個劑量組和陽性藥氟西汀組均可改善上述現象，突觸泡基本不擴張，血管空白區減小。

4 討論

小鼠在懸尾及強迫游泳試驗中出現的不動狀態反映了動物的絕望行為，可模擬人類的抑郁狀態[8]。本次懸尾和強迫游泳試驗結果顯示，知母總皂苷能顯著縮短小鼠懸尾和強迫游泳不動時間，表明知母總皂苷具有抗抑郁作用，可能是通過參與調節中樞不同單胺（去甲腎上腺素、5-羥色胺等）能神經傳導功能所產生的。動物發生抑郁樣行為學改變，反應表現為快感缺乏、運動能力和探索能力下降[9]等，曠場試驗中水平運動反映動物的活動度，垂直運動反映動物對新鮮環境的好奇程度。本實驗知母總皂苷高劑量組能夠顯著增加小鼠水平運動得分、垂直運動得分，從而提高血管性抑郁小鼠的自主運動行為。

圖1 各組小鼠腦組織病理學檢查（HE，200×）A – 假手術組，B – 模型組，C – 鹽酸氟西汀組，D – 低劑量組，E – 中劑量組，F – 高劑量組Fig 1 Pathological examination of brain tissue in mice (HE, 200×)A – sham group, B – model group, C – fluoxetine hydrochloride group, D – low dose group, E – middle dose group, F – high dose group

血管性抑郁發病機制的“炎癥反應假說”認為，年齡及腦血管相關的炎癥過程介導了其抑郁癥的發生[10]。小膠質細胞作為中樞神經系統起免疫監視作用的主要細胞，可在缺血缺氧等多種病理條件下激活，釋放大量促炎性細胞因子參與中樞的免疫炎癥反應[11]。腦卒中患者可引起炎性細胞因子，如白細胞介素IL-1β、IL-18、TNF-α，糖皮激素、腦源性神經營養因子、血管內皮生長因子及組織型纖溶酶原激活物等一系列細胞因子的異常，這些細胞因子參與免疫調節作用及神經遞質的合成代謝，構成了腦卒中后抑郁的發病機制[12]。本實驗采用反復缺血再灌注法制備血管性抑郁小鼠模型，模型小鼠腦內小膠質細胞大量激活，伴有腦內相關促炎性細胞因子水平顯著增高；給予知母總皂苷后，血管性抑郁小鼠腦內促炎性細胞因子水平顯著降低，表明知母總皂苷可以顯著抑制血管性抑郁小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6這三種促炎性細胞因子的表達。提示在以炎癥反應為主導的血管性抑郁癥狀中，知母總皂苷可能是通過抗炎干預起到一定的治療作用。

抑郁與腦缺血有一定關系，兩者互為因果，大腦皮層及海馬等部位神經元損傷有可能是其基本的病理改變[13]。血管性抑郁模型小鼠腦組織光鏡下顯示神經元結構模糊，線粒體腫脹，尼氏小體減少，出現不同程度的核固縮、核溶解，核體不規則；透射電鏡超微結構觀察結果表明，模型小鼠腦神經元細胞變小，細胞核染色質邊集、畸形，血管周圍有空白區。知母總皂苷明顯改善血管性抑郁小鼠腦組織病理學變化，對血管性抑郁模型小鼠腦組織損傷有保護作用。

知母總皂苷抗血管性抑郁作用明顯，其藥材來源廣泛，且中藥不良反應及毒副作用較小，長期服用安全可靠，對其今后的開發和應用有著非常廣闊的前景。中藥具有多環節、多靶點的作用特性，對知母總皂苷抗血管性抑郁的具體作用機制，還有待深入研究。

[1] 黃世敬，張穎，陳宇霞.血管性抑郁發病機制[J].中國老年學雜志，2014，34（17）：5008-5011.

[2] 蔡飛，王維泓，高守紅，等.知母皂苷及其苷元的藥理作用研究進展[J].藥學實踐雜志，2011，29（5）：331-335.

[3] 邢東明，國月英，炎彬，等.缺血再灌卒中后抑郁小鼠模型的建立[J].中國比較醫學雜志，2009，19（3）：14-19.

[4] 王睿，張曉杰，李炎，等.黃豆苷元對抑郁模型小鼠行為及海馬DG區病理形態學影響[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（8）：136-140.

[5] 李樂軍，李玉梅，劉濤.尼麥角林通過調節海馬CA1區單胺類遞質受體表達和血清載脂蛋白E4水平改善血管性抑郁大鼠的抑郁行為[J].國際腦血管病雜志，2016，24（1）：51-57.

[6] 李海龍，劉敏，張海，等.Minocycline對血管性抑郁小鼠抑郁行為及神經遞質的作用[J].中國卒中雜志，2014，9（12）：999-1006.

[7] 趙岳，李永祥，凌鏗，等.柴胡疏肝散聯合氟西汀對產后抑郁癥患者IL-6、IL-1β、TNF-α的影響及其療效[J].中國生化藥物雜志，2016，36（4）：127-129.

[8] 王巍，王曉華.醒腦開郁方抗抑郁作用的實驗研究[J].中國藥物應用與監測，2014，11（5）：279-282.

[9] 譚賽，雷小明，王彥云，等.基于慢性缺血應激建立血管性抑郁癥動物模型[J].首都醫科大學學報，2016，37（2）：196-202.

[10] Alexopoulos GS, Morimoto SS. The inflammation hypothesis in geriatric depression[J]. Int J Geriatr Psychiatry, 2011, 26(11): 1109-1118.

[11] 李海龍，畢曉瑩.小膠質細胞激活介導非特異性炎癥在血管性認知障礙白質脫髓鞘損傷機制中的研究進展[J].中國卒中雜志，2015，10（9）：771-777.

[12] 何浪，邵宏元.腦卒中后抑郁與病灶部位相關性研究進展[J].中華老年心腦血管病雜志，2016，18（10）：1115-1117.

[13] 張穎，陳朝，陳宇霞，等.知母及含知母復方的抗抑郁研究現狀[J].環球中醫藥，2016，9（3）：377-380.

Effects of saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge. on the depressive behaviors of vascular depression mice and brain tissue pathology

GONG Lin1, QIU Yan2, LIU Jing2, LU Yi2, WANG Ya-wei2, DUAN Jing2, MA Jing2, ZHOU Yong3
(1. Outpatient Department, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China; 2. Department of Pharmacy, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China; 3. Instrument Section, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China)

Objective:To investigate the effects of saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge.(SAaB) on the depressive behaviors of vascular depression mice, and the influence of brain tissue pathology and inflammatory factors.Methods:The vascular depression model of mice were established by repeated ischemia and reperfusion. The mice received gastric perfusion of SAaB as designed once per day. After 2 weeks, the depressive behavior changes of vascular depression mice were observed. Contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in brain tissue were measured, meanwhile pathological changes in the brain tissue of mice were analyzed.Results:Compared with the model group, SAaB in middle and high dose group could increase horizontal movement and vertical movement score in open field test (P ＜ 0.05). In the tail suspension test and the forced swimming test of mice, the immobility time of SAaB middle and high dose group was shorter than that of the model group signif i cantly (P ＜ 0.05). Compared with the model group, SAaB in low, middle and high dose groups could signif i cantly inhibit the increase of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the mice brain tissue notably (P ＜ 0.05). The pathological examination showed that SAaB in each dosage group signif i cantly reduced the fuzzy neurons in the brain structure, mitochondria swelling, nissl body, pycnosis, irregular nuclear body in the cerebral cortex pyramidal cells and brain nerve cell nucleus. Compared with the model group, SAaB in each dosage group improved the brain neurons atrophy, synaptic vesicle expansion, nucleus chromatin edge setting, deformity and the blank area around blood vessels.Conclusion:SAaB has signif i cant therapeutic effect on vascular depression mice.

Saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge.; Vascular depression; Behavioral science; Inf l ammatory; Pathology

R964

A

1672 – 8157(2017)02 – 0088 – 05

2016-12-06

2017-03-09）

南京軍區基學科研基金課題（15zD021）

周永，男，高級工程師，研究方向：醫學工程。E-mail：18202138603@163.com

龔林，女，副主任醫師，研究方向：神經內科。E-mail：benefi_bio@163.com