HPLC法測定傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)中的槲皮素含量

劉承清 趙應紅 李曉幸

(1.西雙版納傣族自治州傣醫醫院，云南 西雙版納 666100; 2.西雙版納職業技術學院，云南 西雙版納 666100)

楠果緬(栘木衣樹皮)為薔薇科植物云南栘木衣Docynia delavayi(Franch.)Schneid.的干燥樹皮，于初春剝取樹皮，切片，干燥。傣藥材為塊片或條狀，略彎曲。外表面常呈鱗片狀脫落，外表皮顏色成黃棕色或棕褐色，表面粗糙，有時表皮附有白色地衣斑；切面皮部黃棕色至黃褐色，纖維性，呈層片狀，體重，質硬，斷面不整齊。分布于云南省思茅、西雙版納等地區。生長于海拔400～1800m的山野坡地向陽處。傣藥稱為“楠果緬”，常備當地傣族人民使用。楠果緬(栘木衣樹皮)苦、澀、涼。入水、風、土塔。主要功效有清熱解毒，收斂治瘡，除風止痛，續筋接骨，風濕骨痛。用于燒、燙傷；疔瘡膿腫；皮癬，麻疹，水痘，風疹，濕疹，疥瘡出現的皮膚瘙癢；跌打損傷，骨折；風濕病肢體關節腫痛。楠果緬(栘木衣樹皮)主要含白楊素、槲皮素、廣寄生苷等主要成分[1-3]。目前關于楠果緬(栘木衣樹皮)化學成分研究及含量測定的研究報告很少，只有對楠果緬(栘木衣樹皮)中的白楊素含量測定。筆者通過采用HPLC法測定傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)中的槲皮素含量，為控制此傣藥材的質量具有重要意義，對下一步研究楠果緬(栘木衣樹皮)質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(帶自動進樣器、 二極管陳列檢測器、 LC solution 色譜工作站、)；UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津)；JA2003N電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；LQ-A10002型電子天平(瑞安市樂祺貿易有限公司)；KDM型調溫電熱套(山東省鄄城振興儀器廠)；TA-816型光波爐(中山市天倚電器有限公司)；101-1型電熱鼓風干燥箱(上海試驗儀器廠)等。

1.2 試藥：槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：100081-201610)；娃哈哈純凈水；甲醇、磷酸為色譜純，鹽酸為分析純。傣藥材栘木衣樹皮(批號：20161019)由西雙版納州版納藥業所提供。

2 實驗方法與結果

2.1 對照品溶液的制備: 取槲皮素對照品在電熱鼓風干燥箱恒溫105℃，恒溫干燥2小時，放冷，精密稱定槲皮素對照品4.4mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻、定容，即為對照品溶液(每1mL含槲皮素對照品0.044mg)即得。

2.2 陰性溶液的制備： 量取適量的甲醇(色譜純)置燒杯中，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 供試品溶液的制備： 稱取栘木衣樹皮粉末(過3號篩)約1g,精密稱定，置于150mL圓底燒瓶中，精密量取80%甲醇溶液50mL加入圓底燒瓶中,精密稱定重量。加熱回流1.5h，冷卻，再稱定重量，用80%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續濾液20mL置于100mL三角錐形瓶中，精密加入25%鹽酸溶液7mL，置85℃水浴鍋中水解30min，取出，迅速冷卻，轉移至50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，即得[3]。

2.4 檢測波長的選擇：精密稱取槲皮素對照品一定量，配置成一定濃度的溶液，在200 ～ 700nm處進行波長掃描，結果發現在370nm處吸收峰最大，干擾最少，所以選擇370nm為測量吸收峰。

2.5 色譜條件與系統適用性試驗: 色譜柱：Kromasil C18柱(4.6×150mm，5μm)；流動相：甲醇-0.5%磷酸(49:51)；柱溫：35℃；流速：0.8mL·min-1；檢測波長：370nm[5-7]。分別精密吸取對照品溶液、陰性溶液、供試品溶液各10μL注入高效液相色譜儀中,理論板數按槲皮素峰計算不應低于3500。供試品中槲皮素的色譜峰與相鄰色譜峰達到基線分離。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察:分別精密量取“2.1”項下的槲皮素對照品溶液1mL，2mL，4mL，6mL，8mL，10mL，分別置于10mL容量瓶內，加甲醇稀釋至刻度，將以上6個不同質量濃度對照品溶液分別進樣10μL，照“2.5”項下色譜條件進行測定含量。以峰面積為縱坐標(Y)，槲皮素對照品進樣量為橫坐標(X)繪制標準曲線圖，得到線性回歸方程：Y=49006X-54.918，r=0.9997(n=6)，結果顯示，槲皮素對照品溶液進樣量在4.4～44μg范圍內與峰面積呈良好線性關系，見圖2。

2.6.2 精密度試驗:精密吸取“2.1”項下制備的槲皮素對照品溶液10μL，照“2.5”項下色譜條件進行測定含量，連續進樣6針。結果槲皮素的峰面積RSD為0.07%(n=6)。表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復性試驗: 取同一批傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)樣品約1g,按照供試品溶液制備方法,制備6份供試品溶液,照“2.5”項下色譜條件進行槲皮素含量測定。結果槲皮素峰面積的RSD為0.59%(n=6),結果顯示該方法重復性良好。

2.6.4 穩定性試驗:取重復性試驗中的一份樣品溶液，照“2.5”項下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣10μL測定其峰面積，按照峰面積計算相對標準偏差(RSD)，結果RSD值為0.92%。顯示供試品溶液在24h內穩定性好。

2.6.5 加樣回收率試驗: 稱取已知含量的栘木衣樹皮樣品粉末9份,每份約 1g,精密稱定,分別精密加入不同的濃度槲皮素(4.12599mg/mL5.15749mg/mL、6.18899mg/mL)對照品溶液1mL，照“2.3”項下制備供試品溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾后，在“2.5”項下色譜條件進行含量測定，測定其峰面積，計算含量和加樣回收率。結果見表1，楠果緬(栘木衣樹皮)槲皮素的平均加樣回收率為100.19%，RSD為1.31%。

注：與對照組比較，P<0.05

3 樣品含量測定

稱3批傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)粉末樣品(過三號篩)，每批2份，每份約1g，精密稱定，照“2.3”項下制成供試品溶液。精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，照“2.5”項下色譜條件注入高效液相色譜儀中，用外標法計算楠果緬(栘木衣樹皮)中的槲皮素含量。結果3批楠果緬(栘木衣樹皮)樣品(批號： 161104、170101、170306中槲皮素平均含量分別為5.3306mg/g、5.1001mg/g 5.2507mg/g。

4 討論

4.1 此次試驗對提取方法時，根據文獻報道提取方法有超聲提取法[8]、加熱回流提取法進行提取[9]，提取時間為1.5h后進行比較，結果表明加熱回流提取法提取出的槲皮素的量遠遠大于超聲提取法所提取的。

4.2 通過UV-2450紫外可見分光光度計對槲皮素的波長測定，發現槲皮素在檢測波長為254nm、370nm處有最大吸收值，同時在254nm處雜質吸收值大，干擾性強，不適合檢測。所以選擇在370nm處做為HPLC的檢測波長。

4.3 流動相的考察時，選擇用甲醇：水；乙腈：水；甲醇：(0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)磷酸溶液做流動相的考察系統，確定使用甲醇：0.5%磷酸溶液做為流動相，考察流動相比例50：50、49:51、51:49。最終確定流動相為甲醇：0.5%磷酸溶液(49:51)，進樣速度為0.8 mL/min，檢測波長為370 nm柱溫為35℃條件下進行楠果緬(栘木衣樹皮)含量測定，表明槲皮素可分離，并且分離度高，槲皮素峰形達到基線分離，峰形對稱。

4.4 槲皮素在傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)中含量普遍較高，在西雙版納州資源豐富，傣族人民使用廣泛，因此槲皮素可適用于傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)的含量測定及質量控制，同時可作為西雙版納州傣醫院處方制劑中質量控制成分及其應用提供一定的參考依據。

[1]鄭進,林艷芳.傣藥學[M].北京：中國中醫藥出版社，2007，94.

[2]林艷芳，依專，趙應紅.中國傣醫藥彩色圖譜[M].昆明:云南民族出版社，2003:545.

[3]云南省中藥材標準.第三冊.傣族藥[S].昆明:云南科技出版社，2005,291-303.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(四部)[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015.127.

[6]謝紫薇，李強，劉珊.高效液相色譜法同時測定芒果葉中蘆丁與槲皮素含量[J].中國藥業，2016，25(21)：35.

[7]尹玲，馮蕓，吳珊，等.HPLC法測定菝葜提取物中槲皮素的含量[J].中國藥房，2010,21(35)：3313.

[8]宋偉峰，羅淑媛，李瑞明，梁耀榮.HPLC測定柚寄生中槲皮素的含量[J].藥品鑒定，2012,19(28)：65-68.

[9]陳健.高效液相色譜法測定金錢草片中的槲皮素和山奈素含量[J].中國藥業，2016，25(6)：62-63.