Ang-2及其受體Tie-2在骨肉瘤中的表達(dá)

趙小明 薛新宏 曹曉強(qiáng) 張會(huì)文 李軍 蘇立新 王振旺

·論著·

Ang-2及其受體Tie-2在骨肉瘤中的表達(dá)

趙小明 薛新宏 曹曉強(qiáng) 張會(huì)文 李軍 蘇立新 王振旺

目的 研究Ang-2及其受體Tie-2在骨肉瘤的表達(dá)情況。方法 選取唐山市第二醫(yī)院2009年1月至2011年1月手術(shù)切除的69例骨肉瘤標(biāo)本做為病例組。另取12例正常骨組織標(biāo)本做對(duì)照組。采用RT-PCR法檢測(cè)Ang-2及其受體Tie-2的表達(dá)水平。結(jié)果 骨肉瘤組Ang-2表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；骨肉瘤組Ang-2mRNA表達(dá)與Tie-2mRNA表達(dá)正相關(guān)(r=0.447，P<0.01)。結(jié)論Ang-2及其受體Tie-2參與了骨肉瘤的血管生成及調(diào)控，在骨肉瘤的發(fā)展中起著重要的作用。

骨肉瘤；血管生成素-2；血管生成素-2受體

骨肉瘤發(fā)病率居惡性骨腫瘤首位，出現(xiàn)血運(yùn)轉(zhuǎn)移較早。在很多人類惡性腫瘤的組織、體液、血液中發(fā)現(xiàn)Ang2表達(dá)水平均上調(diào)，與惡性腫瘤的血管密度呈正相關(guān)[1]。本研究對(duì)69例骨肉瘤患者、12例對(duì)照組和骨肉瘤細(xì)胞株MG63的表達(dá)情況，研究Ang-2和其受體Tie-2在骨肉瘤血管生成中的作用，以期為骨肉瘤發(fā)病機(jī)制研究、患者預(yù)后預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例采集唐山市第二醫(yī)院2009年1月至2011年1月臨床手術(shù)切除的69例骨肉瘤標(biāo)本(OS組)。另取同期正常骨組織標(biāo)本12例做對(duì)照(對(duì)照組)。Ang-2及其受體Tie-2的表達(dá)水平采用RT-PCR和Westernblot法檢，；分析OS患者、正常對(duì)照組以及MG63細(xì)胞株中Ang-2表達(dá)與Tie-2的相關(guān)性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng):從液氮罐中取出安瓿并盡快解凍，放入盛有37℃水的搪瓷罐中約2～3min；取出安瓿于操作臺(tái)用吸管吸出細(xì)胞懸液，移入離心管中。小心吹打使細(xì)胞懸浮，并觀察細(xì)胞培養(yǎng)情況；采用低速離心處理，再重復(fù)用培養(yǎng)液漂洗、離心，最后置37℃溫箱培養(yǎng)，第2天更換1次培養(yǎng)液，再繼續(xù)觀察培養(yǎng)。從培養(yǎng)基選取一瓶生長(zhǎng)良好的MG63細(xì)胞，進(jìn)入傳代培養(yǎng)。先用Hank’s液洗1次；0.25%胰蛋白酶液消化液

需要從側(cè)方加入，使細(xì)胞浸沒(méi)在消化液中約1min左右；翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶觀察5～10min，細(xì)胞面如果出現(xiàn)了布紋孔狀現(xiàn)象，則倒出消化液，加入一些新配制的細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管小心吹打數(shù)次，使細(xì)胞均勻分散開(kāi)，按1∶3分配傳代培養(yǎng)。

1.2.2RNA提取、RT-PCR及免疫蛋白印跡分析:RNA提取按Invitrogen公司的說(shuō)明書(shū)利用Trizol進(jìn)行RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后應(yīng)用PCR擴(kuò)增及檢測(cè)，Westernblot法做免疫蛋白印跡分析

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料的檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Ang-2mRNA的表達(dá) 人骨肉瘤細(xì)胞系MG63高表達(dá)Ang-2mRNA(0.37±0.05)。骨肉瘤患者中Ang-2陽(yáng)性率為81.2%，對(duì)照組陽(yáng)性率為16.7%，兩組Ang-2陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；骨肉瘤組Ang-2mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(0.35±0.12vs0.05±0.02，P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2Ang-2蛋白的表達(dá) 人骨肉瘤細(xì)胞系MG63中Ang-2蛋白顯示高表達(dá)；對(duì)照組未檢測(cè)到表達(dá)；骨肉瘤患者中，Ang-2蛋白的陽(yáng)性率和表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 Ang-2在骨肉瘤患者和對(duì)照組表達(dá)情況

注: 與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 骨肉瘤中Ang-2與Tie-2表達(dá)的關(guān)系 在56例Ang-2mRNA陽(yáng)性標(biāo)本中，有49例Tie-2mRNA表達(dá)陽(yáng)性；在13例Ang-2陰性標(biāo)本中，有7例Tie-2mRNA表達(dá)陰性，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析證實(shí)：Ang-2、Tie-2mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.447，P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 骨肉瘤中Ang-2與Tie-2表達(dá)的關(guān)系 例(%)

3 討論

骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的惡性腫瘤，起源于間葉組織。它具有富含血管，腫瘤生長(zhǎng)迅速、早期易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，因此成為腫瘤血管方面研究的重要對(duì)象[2-5]。而腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成[6]，骨肉瘤目前治療是以擴(kuò)大或根治性的截肢術(shù)為主要手段，術(shù)后輔以化療。盡管近年來(lái)手術(shù)治療方式和化療藥物應(yīng)用已取得重大進(jìn)展[7,8]，但骨肉瘤易發(fā)生多藥耐藥現(xiàn)象，其5 年生存率并沒(méi)有取得明顯提高[9]。因此，深入骨肉瘤分子機(jī)制研究，尋找新的治療靶點(diǎn)，已成為臨床亟待解決的問(wèn)題。

骨肉瘤的分子機(jī)制復(fù)雜，尚有諸多機(jī)制不清楚。血管新生受多種因素調(diào)控，其中Ang-2 的表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、生長(zhǎng)和侵襲、轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系[10,12]，在血管肉瘤、膠質(zhì)瘤、胃癌、乳腺癌等研究中發(fā)現(xiàn)Ang-2高表達(dá)[13,14]，確立了Ang-2 在腫瘤發(fā)展和臨床結(jié)局中的預(yù)測(cè)價(jià)值。目前在對(duì)肺癌、腎癌等實(shí)體瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Ang-2 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌VEGF，同樣VEGF也可以促進(jìn)Ang-2的分泌，Ang-2與VEGF聯(lián)合作用可以使新生血管長(zhǎng)度和增生范圍增大[15,16]。

本研究對(duì)69例骨肉瘤患者、人骨肉瘤細(xì)胞系MG63和12例對(duì)照組Ang-2 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者和人骨肉瘤細(xì)胞系MG63的Ang-2表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，提示Ang-2表達(dá)與骨肉瘤密切相關(guān)；可能參與骨肉瘤患者腫瘤骨組織血管新生過(guò)程，Ang-2可能通過(guò)離斷血管外周細(xì)胞，使其呈稀薄、有漏洞的形態(tài)，阻止血管進(jìn)一步分化成熟，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。

Tie-2是Ang-2的膜受體；其表達(dá)水平間接反應(yīng)Ang-2作用方式。本研究結(jié)果顯示，Tie-2與Ang-2在骨肉瘤腫瘤骨組織中表達(dá)呈正相關(guān)，提示Tie-2與Ang-2可能協(xié)同參與了骨肉瘤血管生成過(guò)程。由于Ang-2即可由腫瘤細(xì)胞分泌，也可由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，而腫瘤骨組織同時(shí)高表達(dá)Tie-2，提示腫瘤骨組織可能同時(shí)存有Ang-2/Tie-2的自分泌和旁分泌系統(tǒng)；其介導(dǎo)的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能正是Ang-2誘導(dǎo)腫瘤性血管形成、參與骨肉瘤發(fā)病過(guò)程的重要途徑[17]，Tie-2是Ang-2的檢測(cè)將為骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制研究、患者預(yù)后預(yù)測(cè)提供較好的理論依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.037

063000 河北省唐山市第二醫(yī)院(趙小明、曹曉強(qiáng)、張會(huì)文、李軍、蘇立新、王振旺)；華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院(薛新宏)

薛新宏，063000 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院；

E-mail:xxhzxm129@sohu.com

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1002-7386(2017)08-1246-02

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