卵巢癌細胞系SKOV3培養上清對巨噬細胞共刺激分子的影響

宋玉霞 趙濤 張瑋璨 郭清 王宏衛 孟桐羽

·論著·

卵巢癌細胞系SKOV3培養上清對巨噬細胞共刺激分子的影響

宋玉霞 趙濤 張瑋璨 郭清 王宏衛 孟桐羽

目的 研究卵巢癌細胞系SKOV3培養上清處理巨噬細胞后,巨噬細胞亞型的改變，以及CD80、CD86、CD40在不同巨噬細胞亞型上表達的差異。方法 Ficoll 密度梯度法分離健康成人外周血單個核細胞，GM-CSF誘導為巨噬細胞(M0)后，用對數生長期的SKOV3細胞培養上清處理14 d后，采用流式細胞術檢測巨噬細胞亞型的改變及不同亞型細胞CD80、CD86和CD40的表達情況。結果 流式細胞術檢測顯示，用SKOV3細胞培養上清培養巨噬細胞14 d后，巨噬細胞主要向CD163-M2型巨噬細胞分化[M1/M2=(12.37±1.76)%/(22.23±2.21)%]。CD163-M2型巨噬細胞CD40的表達較CD64-M1型顯著降低，2組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；而CD80、CD86的表達無明顯改變，2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論SKOV3細胞培養上清刺激后的巨噬細胞向不同巨噬細胞亞型分化；M2型巨噬細胞較M1型巨噬細胞共刺激分子表達下調，提示這些共刺激分子在巨噬細胞的活化及免疫應答過程中很重要，可能與腫瘤細胞的免疫逃逸有關。

卵巢癌；M2型巨噬細胞；CD80/CD86/CD40

卵巢癌是婦科腫瘤中惡性程度最高的疾病，腹膜轉移是晚期卵巢癌的特征之一。晚期卵巢癌患者腹水微環境的浸潤細胞包括內皮細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、巨噬細胞等等，其中巨噬細胞是含量最豐富的免疫細胞。近年來研究發現，M2型巨噬細胞浸潤數量和卵巢癌預后有顯著的相關性[1]。本課題組前期研究發現，在卵巢癌晚期患者腹水中，主要是M2型巨噬細胞，而非M1型巨噬細胞。這提示M2型巨噬細胞在腫瘤的增殖及遠處轉移中發揮重要作用。查閱文獻發現，M1型巨噬細胞和M2型在某些細胞因子的表達上有所差異[2]。本實驗通過研究CD68、CD80及CD40在M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞表達的差異，初步篩選出腫瘤細胞中的關鍵分子靶點，為解釋卵巢癌的腹腔播散和轉移提供新的線索，并為卵巢癌分子靶點的干預策略提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 1640培養基，卵巢癌細胞系SKOV3。

1.2 方法

1.2.1 采集健康成人外周血，Ficoll 密度梯度法收集中間層單個核細胞(1 000 r/min，20 min，23℃)， PBS重懸后再次離心 (800 r/min，7 min，23℃)。

1.2.2 巨噬細胞培養：細胞以不含血清的RPMI1640重懸后種于100 mm細胞培養皿，細胞種植密度為1.0×106/ml，培養箱中靜置 2 h 使細胞貼壁，用預熱的PBS潤洗3次， 除去懸浮細胞。加入10%FBS-RPMI1640和GM-CSF，置入37℃,5%CO2培養箱培養，備用。

1.2．3 用對數生長期的SKOV3細胞培養上清處理14 d后，以免疫熒光的方式鑒定分離培養巨噬細胞純度。細胞刮輕刮培養皿收集巨噬細胞，離心收集細胞沉淀1 200 r/min， 5 min，23℃。棄上清，以CD68抗體標記巨噬細胞，37℃，1 h。PBS洗滌3遍，標記熒光二抗，37℃，1 h。PBS洗滌3遍，Hocest染核5 min。PBS洗滌3遍，熒光顯微鏡觀察，統計。

1.2.4 SKOV3細胞培養上清培養巨噬細胞：用對數生長期的SKOV3細胞培養上清處理M0巨噬細胞14 d。

1.2.5 巨噬細胞各亞型比例的檢測：以CD64作為M1型巨噬細胞的表面標記，以CD163作為M2型巨噬細胞的表面標記。收集細胞，取1.0×106個細胞，標記上述熒光抗體，流式細胞學檢測M1、M2所占百分。

1.2.6 巨噬細胞CD80、CD86和CD40的表達的檢測：收集SKOV3細胞培養上清處理14 d后的細胞，取1.0×106個細胞，標記熒光抗體M1、M2及CD80、CD86和CD40，流式細胞學檢測M1、M2中CD80、CD86和CD40的表達情況。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測巨噬細胞表面標記(CD64，CD163)表達情況SKOV3細胞培養上清培養巨噬細胞14d后，M1型巨噬細胞占(12.37±1.76)%，M2型巨噬細胞占(22.23±2.21)%，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。由此可見，SKOV3細胞培養上清培養巨噬細胞14d后，M0主要向M2型巨噬細胞分化。見圖1。

2.2 不同巨噬細胞亞型中，CD80、CD86和CD40表達的檢測SKOV3細胞培養上清培養巨噬細胞14d后，流式細胞術檢測不同細胞因子的表達情況，結果如下圖。CD80在CD64-M1、CD64-M2上表達所占百分比分別為：(7.50±1.10)%、(6.60±0.98)%，2組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；CD86在CD64-M1、CD64-M2上表達所占百分比分別為：(10.53±1.52)%、(10.30±1.50)%，2組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；CD40在CD64-M1、CD64-M2上表達所占百分比分別為：(10.22±1.10)%、(2.50±0.32)%，2組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、3。

圖1 流式細胞術檢測巨噬細胞表面標記(CD64，CD163)表達情況

圖2 不同巨噬細胞亞型中，CD80、CD86和CD40的表達的檢測

圖3 不同巨噬細胞亞型中，CD80、CD86和CD40的表達的檢測

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統腫瘤中死亡率最高的疾病。近年來，對于惡性腫瘤的治療出現了一些分子靶向治療藥物，像Herceptin,Gleevec,Sorafenib等。但是卵巢癌的分子靶向治療藥物仍未獲得突破性進展。分子靶向藥物在臨床應用中暴露的一些問題使得人們逐漸把目光轉移到生物免疫治療上來。腹腔巨噬細胞與卵巢癌腫瘤細胞相互作用的研究，對揭示卵巢癌惡性表型有重要意義，同時還能對卵巢癌的免疫治療提供理論基礎。卵巢癌與免疫微環境相互作用的研究與日俱增，為闡明卵巢癌惡性表型機制提供新的線索。

研究發現：腹腔微環境對卵巢的進展與播散用重要作用，晚期卵巢癌患者多有惡性腹水形成，腹水中富含腫瘤相關巨噬細胞(TAM)，TAM對卵巢癌耐藥與播散有重要意義[1]。在晚期惡性腹水中分離出的腫瘤TAM高表達CD163，這種CD163的高表達與卵巢癌的早期復發和腹水IL-6、IL-10的表達水平相關。朱亞飛等[2]研究發現：卵巢癌組織中存在M0向M2型的分化，且M2細胞比例是卵巢癌預后不良的預測因素。M2細胞百分比是卵巢癌預后的負相關因素,M1、M2密度與卵巢癌預后無關。而卵巢癌組患者生存率曲線顯示,M2密度及M2細胞百分比與患者生存時間有關?？梢奙2細胞比例是影響卵巢癌預后的因素。

張婷等[3]研究發現：EOC腹膜內激活的因子與浸潤TAM相互作用關系,提示EOC微環境內 激活的因子可能是誘導外周血單核細胞和巨噬細胞(MO/MA)分化和極化為M2型細胞的一個新的分子,表明EOC微環境中凝血系統的因子除直接作用腫瘤細胞外,還通過作用于基質內巨噬細胞促進腫瘤的侵襲、浸潤及血管生成。很有可能凝血因子與在EOC種植灶附近MO/MA相互作用產生的趨化因子、細胞因子網絡為腫瘤細胞沿腹膜表面種植鋪平了道路。另研究發現：卵巢癌惡性進展與卵巢癌微環境密切相關，通過構建腹腔炎性環境老鼠模型，人卵巢癌腹腔注射，觀察腹腔炎性環境對卵巢癌進展的影響，發現腹腔炎性環境能夠促進卵巢的腹腔播散和腹水形成[4]。并且這種現象和腹腔巨噬細胞，間皮細胞分泌的血管內皮生長因子(VEGF)密切相關。

值得注意的是Tanaka等[5]在對89例卵巢癌患者的回顧性研究中發現:TAMs分泌的Bikunin是一種Kunitz-type蛋白酶抑制劑,通過下調uPA的表達,為無瘤生存率(P=0.040)和總生存期(P=0.042)提高的一項獨立的預后因素。這個結果與上述其他研究對TAMs在腫瘤預后上的結論不一。

宿主抗腫瘤免疫反應可明顯改善卵巢癌患者的預后及生存率，通過加強卵巢癌患者的宿主抗腫瘤免疫反應，可顯著影響卵巢癌患者的預后[6]。已有研究表明，M2型巨噬細胞可以減弱急性期炎癥反應，抑制免疫應答，促進腫瘤細胞的增殖及遷移能力，并能夠誘導局部免疫耐受狀態[7]。通過本實驗可以發現，用SKOV3培養上清處理后的巨噬細胞，除了亞型轉變之外，還有共刺激分子(CD86、CD80、CD40)的改變，這些共刺激分子在巨噬細胞的活化及免疫應答過程中很重要，共刺激分子表達降低會導致巨噬細胞不能產生殺傷腫瘤細胞，從而導致腫瘤細胞的免疫逃逸。其中表達降低的主要是CD40。CD40可以促進凋亡和Fas基因的表達，并且可以加強抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用。

在單核巨噬細胞中，CD40與CD40的受體CD40L結合后可上調其表面的CD54、CD80、CD86及MHCII的表達，增強抗原遞呈的作用[8],這也可能是該實驗中CD86在M2型巨噬細胞的表達與M1型巨噬細胞無明顯差異的原因；CD40-CD40L還可以促進IL-6、IL-8、IL-12和MMPs的分泌[9]?；罨腡h2細胞高表達CD40L,可與B細胞表面的CD40結合,產生B細胞活化的第二信號,協同刺激B細胞活化、增殖和分化成漿細胞并產生抗體，如果CD40-CD40L的相互反應中斷可誘導B細胞的免疫耐受[10]。CD40 與腫瘤血管形成有關,可促進腫瘤細胞的生長[11]。然而,CD40-CD40L結合反應可誘導腫瘤細胞凋亡,促進抗原提呈細胞的活化,產生抗腫瘤的免疫反應。CD40L可抑制IL-10和TGF-β的產生,誘導腫瘤部位的Th1反應,進而抑制腫瘤的發生[12]。激活的T細胞通過CD40-CD40L反應調節內皮細胞上MMPs表達，內皮細胞上CD40的表達又可誘導上皮細胞MMP-9表達，提高MMP-1和MMP-3的水平，激活MMP-2。內皮細胞上CD40的表達可引起血管重建，從而為腫瘤的浸潤和轉移提供物質基礎[13]。原發性和復發性卵巢癌組織以及卵巢癌腹水中均可檢測到CD40，腹水中CD40含量明顯高于實體腫瘤組織中CD40的表達，在原發性卵巢癌中的表達又明顯高于復發卵巢癌組織[14]。因此，CD40表達水平的檢測可作為復發卵巢癌檢測的指標之一。CD40在腫瘤的基因治療中已得到越來越多的應用。CD40、CD40L以及CD40/CD40L的結合反應與癌細胞間作用的分子機制相當復雜，需要進一步研究來闡明它們之間的關系。

目前，不同學者對TAM與卵巢癌的相互作用提出各自看法，基本集中在腫瘤組織、腹膜、腸系膜中TAM的密度、比率或者分泌的細胞因子與卵巢癌預后的關系等方面。不同研究對TAM與卵巢癌預后關系也說法不一。對其研究多停留在與預后關系的報道，但相互作用的具體機制、特異的分子靶點報道較少，而這正是指導免疫靶向治療的關鍵，是有待我們進一步闡明的問題。

1ReinartzS,SchumannT,FinkernagelF,etal.Mixed-polarizationphenotypeofascites-associatedmacrophagesinhumanovariancarcinoma:correlationofcd163expression,cytokinelevelsandearlyrelapse.IntJCancer,2014,134:32-42.

2 朱亞飛,胡愛民,張振東,等.卵巢癌組織中m2型巨噬細胞密度變化及其與卵巢癌預后的關系.山東醫藥,2011,51:7-9.

3 張婷,馬政文,王穎,等.凝血因子Ⅱ可誘導單核細胞和巨噬細胞分化為卵巢癌腹膜內腫瘤相關巨噬細胞.中國實用婦科與產科雜志,2009,4:29-32.

4Robinson-SmithTM,IsaacsohnI,MercerCA,etal.macrophagesmediateinflammation-enhancedmetastasisofovariantumorsinmice.CancerRes,2007,67:5708-5716.

5TanakaY,KobayashiH,SuzukiM,etal.Upregulationofbikuninintumor-infiltratingmacrophagesasafactoroffavorableprognosisinovariancancer.GynecolOncol,2004,94:725-734.

6Mantia-SmaldoneGM,ChuCS.immunotherapyinovariancancer.HumVaccineImmunother,2012,8:1179-1191.

7AlbertoMantovani,PaolaAllavena,AntonioSica,etal.Cancer-relatedinflammation.Nature,2008,454:436-444.

8Feder-MengusC,Schultz-ThaterE,OertliD,etal.NonreplicatingrecombinantvacciniavirusexpressingCd40ligandenhancesapccapacitytostimulatespecificCd4+andCd8+Tcellresponses.HumGeneTher,2005,16:348-360.

9ScottK,ManuntaM,GermainC,etal.Qualitativelydistinctpatternsofcytokinesarereleasedbyhumandendriticcellsinresponsetodifferentpathogens.Immunology,2005,116:245-254.

10LoskogA,DzojicH,VikmanS,etal.AdenovirusCd40ligandgenetherapycounteractsimmuneescapemechanismsinthetumorenvironment.JImmunol,2004,172:7200-7205.

11ThorstenV,KatherineC,WoodR,etal.DifferentialexpressionandregulationofmurineCd40inregionalvascularbeds.AmericanJournalofPhysiology.HeartandCirculatoryPhysiology,2006,290:631-639.

12AndradeRM,WessendarpEA.Tnfreceptor-associatedfactor6-dependentCd40signalingprimesmacrophagestoacquireantimicrobialactivityinresponsetotnf-alpha.TheJournalofImmunology,2005,175:6014-6021.

13Smola-HessS,SchnitzlerR,HadaschikD,etal.Cd401inducesmatrix-metalloproteinase-9butnottissueinhibitorofmetalloproteinases-1incervicalcarcinomacells:imbalancebetweennf-kappabandstat3activation.Experimentalcellresearch,2001,267:205-215.

14CiaravinoG,BhatM,ManbeianCA,etal.Differentialexpressionofcd40andCd95inovariancarcinoma.Europeanjournalofgynaecologicaloncology,2004,25:27-32.

Effects of culture supernatant of ovarian cancer cell line-SKOV3 on costimulatory molecules of macrophages

SONGYuxia*,ZHAOTao*,ZHANGWeican,etal.

*DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstHospitalofShijiazhuang,Shijiazhuang050011,China

Objective To investigate the changes of subtypes of macrophage treated by culture supernatant of ovarian cancer cell line-SKOV3 in vitro,and to explore the differences of expressions of CD80,CD86,CD40 in different subtypes of macrophage.Methods The peripheral blood mononuclear cells were separated from healthy adults by Ficoll density gradient method,which were induced into macrophages by GM-CSF.Then the macrophages were cultured in supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells at exponential growth phase for 14 days. The changes of subtypes of macrophage and the expression levels of CD80,CD86,CD40 in different subtypes of macrophages were detected by flow cytometry.Results The examination results by flow cytometry showed that after the macrophages were treated in supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells for 14 days, the macrophages were mainly differentiated into CD163-M2 subtype macrophages [M1/M2=(12.37±1.76)%/(22.23±2.21)%]. The expression levels of CD40 in CD163-M2 subtype macrophages were significantly decreased,as compared with those in CD64-M1 subtype macrophage (P<0.05).HowevertherewerenosignificantdifferencesintheexpressionlevelsofCD80andCD86betweentwogroups(P>0.05).Conclusion After the macrophages are treated in culture supernatant of SKOV3 ovarian cancer cells,which are differentiated into different subtypes.Moreover the expression levels of costimulatory molecules are down-regulated in M2 subtype macrophages,as compared with those in M1 subtype macrophages ,which suggests that these costimulatory molecules play an important role in activation of macrophages and immune response,which may be correlated to immune escape of tumor cells.

ovarian carcinoma;M2 subtype macrophages; CD80/CD86/CD40

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.006

050011 河北省石家莊市第一醫院婦產科(宋玉霞、趙濤、郭清、王宏衛、孟桐羽)；河北醫科大學(張瑋璨)

郭清，050011 河北省石家莊市第一醫院婦產科；

E-mail:syx810511@126.com

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A

1002-7386(2017)08-1144-04

2016-12-13)