新西蘭大白兔組織工程骨的構建及體內異位成骨效果

李海旭， 石繼祥， 石文俊， 劉孚瑛， 章篩林， 周 強

上海中醫藥大學附屬普陀醫院骨科， 上海 200062

·短篇論著·

新西蘭大白兔組織工程骨的構建及體內異位成骨效果

李海旭， 石繼祥， 石文俊， 劉孚瑛， 章篩林， 周 強*

上海中醫藥大學附屬普陀醫院骨科， 上海 200062

目的： 探討新西蘭大白兔組織工程骨股骨旁異位成骨(ectopic bone formation)的效果。方法： 選取新西蘭大白兔骨髓基質干細胞進行成骨誘導，與生物陶瓷構建組織工程骨，種植到新西蘭大白兔股骨的骨膜旁，第8周獲得異位成骨組織，檢測分析收獲的異位成骨材料結構。結果： 第8周的異位成骨材料內有骨組織形成，成骨材料結構清晰，組織內部有新血管形成，熒光蛋白標記的標本有熒光蛋白表達。結論： 組織工程骨在體內可順利異位成骨。

組織工程骨；異位成骨；結構

臨床上大量骨缺損的修復一直是個難題，相對自體骨、異體骨和人工合成材料使用的局限性，組織工程骨具有良好的相容性和可重復性，有望成為骨缺損修復的良好材料[1]。移植的干細胞與周圍微環境的相互作用非常重要，局部組織微環境可以影響干細胞的黏附和遷移，血供良好顯然可以更好地促進成骨[2]。本研究將組織工程骨種植到軟組織條件正常的股骨旁進行異位成骨(ectopic bone formation)研究，并對其成骨過程、內部結構進一步分析。

1 材料與方法

1.1 骨髓基質干細胞培養和成骨誘導 取實驗用4周齡新西蘭大白兔1只，體質量為1.5 kg，經兔耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉，按1 mL/kg的劑量行全身麻醉。于雙側脛骨近端作骨穿，穿刺成功后用含有0.2 mL肝素鈉溶液的注射器取骨髓4.0 mL，骨髓轉移至離心管，再加入等量的PBS洗滌后離心5 min，重復2次。棄上清液，加入含有10%體積血清的培養基重懸后接種于100 mL的塑料培養瓶中，置于37℃、體積分數5%CO2的培養箱中培養，3 d后半量換液，此后每2 d全量換液。待原代培養細胞鋪滿瓶底面積80%～90%時，加入0.25%的胰蛋白酶消化2.0～3.0 min，加入含有血清的L-DMEM培養基終止消化，離心5 min，棄上清液，吹打細胞后以1∶2接種，并對獲得的骨髓基質干細胞形態學觀察。用DMEM條件培養基(含10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸納、0.05 mmol/L抗壞血酸)進行成骨誘導[3]。取部分成骨誘導后的基質干細胞進行堿性磷酸酶染色確認成骨活性。取部分成骨誘導后的基質干細胞，利用熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)慢病毒包裝載體進行熒光蛋白標記(上海澳斯生物技術服務有限公司協助完成)。胎牛血清購自杭州四季青公司，其他試劑購自Sigma公司。

1.2 組織工程骨的構建 成骨誘導后的基質干細胞懸液(107個/ mL)滴加到12 mm×6 mm×6 mm的β-磷酸三鈣生物陶瓷(實驗專用)柱狀體支架并完全浸潤，按原條件培養3 d后待用，β-磷酸三鈣生物陶瓷由上海貝奧路生物材料有限公司提供。

1.3 異位成骨材料獲取 取6只清潔級新西蘭大白兔，按0.3 mL/kg的劑量進行靜脈注射1%戊巴比妥鈉麻醉。麻醉后嚴格消毒，將組織工程骨置于雙側股骨旁，逐層縫合軟組織，術后未予以抗生素，繼續飼養實驗動物。標記組2只大白兔植入GFP標記的組織工程骨；無標記組4只植入無標記的組織工程骨，第8周取材分析。標記組材料作冰凍切片；無標記組的新西蘭大白兔4只左心室內灌注凝膠墨汁，待末梢循環可見黑色后取材，包括股骨和周邊附著的異位成骨材料一起聚酯液包裹固定，7 d后做硬切片觀察內部結構。

2 結 果

2.1 成骨干細胞誘導與GFP標記 骨髓基質干細胞鏡下為梭狀單核細胞，有偽足吸附在培養皿表面，擴增后進行成骨誘導12 d，細胞仍然為梭狀單核細胞，貼壁良好(圖1A)，細胞的成骨誘導效果通過堿性磷酸酶染色陽性得到確認(圖1B)，GFP熒光蛋白慢病毒包裝載體可將成骨誘導后的基質干細胞標記上GFP(圖1C)。

圖1 成骨干細胞誘導、堿性磷酸酶的成骨鑒定與GFP標記

A：骨髓基質干細胞成骨誘導第11 天；B：成骨誘導后的干細胞堿性磷酸酶染色陽性；C：綠色熒光蛋白標記的干細胞.Original magnification:×200

2.2 獲得異位成骨材料 組織工程骨直接置于雙側股骨旁(圖2A)，實驗動物均無死亡或局部創口感染，大部分骨膜旁成骨材料固定充分，形態為類似植入前的完整柱狀(圖2B)，少部分異位成骨材料有吸收和碎裂，不再作進一步檢測分析。

圖2 組織工程骨的植入與異位成骨材料的獲取

A：條狀組織工程骨植入股骨外側；B：8周后異位成骨材料附著牢固，形態完整

2.3 標記GFP組織工程骨在異位成骨后GFP的表達 GFP慢病毒包裝載體標記干細胞培養過程中發現，成骨誘導前標記的干細胞存活和增殖能力下降，未用于后期實驗。成骨誘導9 d后再進行GFP標記，原條件培養2 d后擴增1次，細胞存活良好(圖1C)，用于標記組實驗，獲得的異位成骨材料形態完整，取出直接做冰凍切片，雖然組織容易破碎，仍然可見明確的GFP表達(圖3)。

圖3 熒光蛋白在異位成骨材料中的表達

A：第8周，冰凍切片后組織容易碎裂；B：異位成骨材料中有明確的GFP表達.Original magnification: ×40(A), ×200(B)

2.4 異位成骨材料的結構分析 標本股骨F(femur)和異位成骨材料E(ectopic bone)的橫切面切片觀察(圖4)：可見無標記組6個異位成骨標本形態完整，牢固附著于股骨旁(圖4A)。正常股骨皮質內哈弗管被墨汁染成黑色，清楚顯示，異位成骨材料有類似骨組織結構形成，形態良好(圖4B)；骨組織內的血管樣結構和彌漫分布的骨細胞清晰(圖4C)。邊緣附著的組織工程骨，有類似正常骨組織的骨樣結構和骨細胞，部分血管樣結構(圖4D)。由于聚酯液固定的組織切片較厚，光學顯微鏡最大放大到200倍，可以觀察到異位成骨材料內的細胞大小和結構類似正常骨組織，無法對細胞結構仔細辨認分析，不能確認成骨細胞或破骨細胞。

圖4 股骨旁異位成骨材料與正常股骨結構的對照

A：股骨標本橫切面切片，完整的股骨F(femur)干邊緣附著異位成骨材料E(ectopic bone)；B：股骨與異位成骨材料結構相似；C：正常股骨內有血管和骨細胞結構；D：異位成骨材料內新生血管和骨細胞樣結構.Original magnification: ×10(A), ×40 (B), ×200(C,D)

3 討 論

作為自體骨的替代材料，組織工程骨具有數量和質量上的優勢，利用自體干細胞作為種子細胞、人工骨作為支架材料構建組織工程骨的方法一直是研究熱點[12]。多種來源干細胞構建的組織工程骨均有不同的骨缺損修復能力，骨髓來源的基質干細胞具有取材方便，成骨能力強等優勢[4]，而且比其他來源的基質干細胞釋放更多的血管內皮生長因子，可以促進血管再生，為骨形成創造更好的條件[4-5]。

骨髓內各種細胞總數的0.01%是基質干細胞，如此少的數量限制了直接移植修復骨缺損的可行性[6]。只有在體外對骨髓基質干細胞進行擴增誘導后，才可能期望植入體內獲得較多的骨組織[1]。

本研究選取骨髓基質干細胞順利擴增后進行成骨誘導，通過堿性磷酸酶染色確認其具有成骨活性。選作支架的β-磷酸三鈣生物陶瓷是臨床上常用的骨缺損修復填充物，主要成分為無機物，自身基本無成骨作用，其形態規則、性能穩定，多孔結構有利于細胞植入的特性，是組織工程骨的優良支架。

組織工程骨攜帶的基質干細胞可以通過多渠道促進成骨，一方面自身轉化為成骨細胞，另一方面釋放各種遞質，募集各種有利骨形成的細胞至其周邊，其中還包括宿主本身的基質干細胞[7]。有許多實驗室研究直接將構建的組織工程骨植入骨缺損，可以獲得良好的骨缺損修復效果，但從臨床應用方面考慮，該類方法有相當多的限制，一般骨缺損部位往往伴軟組織損傷，不能提供良好的血供，骨折部位抵抗力較弱，容易發生變態反應或感染，局部微環境不利于干細胞的存活。如果同時有金屬內固定材料，可能會造成災難性的感染。異位成骨的方法為將組織工程骨植入到體內非骨折的部位，如皮下、肌筋膜下和骨膜旁等[8-10]，利用局部良好的微環境提供所需的血供和其他有利條件，促進其形成需要的骨組織。

異位成骨的干細胞究竟可以存活多久，是否直接參與骨形成，往往需要通過干細胞的標記物確認。基因追蹤可用于異種干細胞移植[10]，精確定位植入的種子細胞，而同種移植顯然熒光蛋白標記更加便捷。本研究熒光蛋白標記的組織工程骨在體內第8周有明確的熒光顯示，種子細胞能在體內較長時間存活，不排除其在體內進一步分化、增殖，積極參與骨組織形成。

本研究應用的是同種異體干細胞構建組織工程骨，在宿主體內未發生炎性反應或排異，為臨床應用提供了安全保障支持。已經有學者[11,13]利用人體骨髓基質干細胞進行擴增誘導，與多孔支架構建組織工程骨植入裸鼠皮下，獲得了良好的異位成骨，且沒有明顯的炎性反應，提示在克服免疫反應的基礎上，有可能利用異位成骨方法獲得修復骨缺損的優良材料。

異位成骨材料修復骨缺損過程相對復雜、影響因素較多，涉及到骨髓基質干細胞的培養、成骨干細胞的誘導、支架材料的選擇、異位成骨部位和手術方式的選擇等一系列因素，任何環節出現異常均不可能獲得滿意的結果。本研究結果提示異位成骨可以獲得成功，有望為臨床骨缺損的修復提供優良的填充材料。

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[本文編輯] 葉 婷， 曉 路

The structure analysis of ectopic bone formed by engineered bone in the New-Zealand rabbits

LI Hai-xu, SHI Ji-xiang, SHI Wen-jun, LIU Fu-ying, ZHANG Shai-lin, ZHOU Qiang*

Department of Orthopaedic, Putuo Hospital, Shanghai Traditional Medical University, Shanghai 200062, China

Objective： To study the structure of ectopic bone formed beside the New-Zealand rabbit femoral bone.Methods： Bone marrow stroma stem cells (BMSCs) were taken from New-Zealand rabbits to built engineered bone constructs, the constructs were embedded near the rabbit femoral bone, the ectopic bone constructs were harvested at 8thweek for further examination and study.Results： At 8thweek, the ectopic bone had a clear bone-like structure, together with new blood supply, green fluorescent protein could be seen in samples seeded by marked cells.Conclusions： This study showed that the ectopic bone formation could be successfulinvivo.

engineered bone constructs; ectopic bone formation; structure

2016-08-01 [接受日期] 2017-01-05

上海市衛生和計劃生育委員會科研課題(20114205).Supported by Research Project of Shanghai Health and Family Planning Commission (20114205).

李海旭，碩士生.E-mail: 553606395@qq.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-22233252, E-mail: zhouqiang619@aliyun.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160775

R 683

A