煙草CSN4基因的原核表達(dá)及純化

龔露　鐘杰　高潔　佟碩秋　吳擁軍

摘要：以野生型煙草（Nicotiana tabacum）為試驗材料，采用RT-PCR克隆獲得CSN復(fù)合體亞基CSN4cDNA序列，基因登錄號為 KC866360。序列分析表明，CSN4基因ORF長為 1194bp，編碼398個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為4378kDa。將CSN4構(gòu)建至原核表達(dá)載體，獲得重組子pET28a-CSN4/BL21（DE3），通過 Ni-IDA 親和層析純化目的蛋白，SDS-PAGE 和Western Blotting 檢測，結(jié)果顯示：025mM IPTG，15℃誘導(dǎo)16h獲得濃度為0476mg/mL、純度高達(dá)95%的CSN蛋白，為后續(xù)CSN4基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：COP9信號復(fù)合體；基因克隆；原核表達(dá)；親和純化

中圖分類號：Q78

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2017）02-0019-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.004

Abstract：In this study， the COP9 signal complex subunit CSN4 cDNA sequence was cloned by RT-PCR amplification from the wild type Nicotiana tabacum， accession number KC866360 in GenBank database. Sequence analysis showed that the length of open reading frame of N. tabacum CSN4 gene was 1194bp， encoding 398 amino acids， and the molecular weight of the protein is 43.78kDa. The recombinant pET28a-CSN4/BL21 （DE3） had been obtained by cloning CSN4 gene into the prokaryotic expression vector pET28a. The target protein was purified by Ni- IDA affinity chromatography， and the results of SDS-PAGE and Western Blotting indicated that the recombinant strain was induced with 0.25mM IPTG at 15℃ for 16h， the target protein concentration was 0.476mg/mL and its purity was up to 95%， which was laid the foundation for further study protein-function.

Key words：COP9 signalosome； gene clone； prokaryotic expression； affinity purification

COP9（constitutively photomorphogennic 9）信號復(fù)合體（CSN）最早是在擬南芥光形態(tài)建成中發(fā)現(xiàn)，是植物光形態(tài)發(fā)生的一個負(fù)調(diào)節(jié)子[1]，CSN復(fù)合體由 8 個不同亞基組成，可依次命名為 CSN1-CSN8[2]。這一復(fù)合體亞基從多種生物中被克隆及分析，如家蠶、菊花、甘藍(lán)型油菜、蘋果、水稻等[3-7]。研究表明CSN是通過對SCF型E3-泛素連接酶（cullin蛋白）的去NEDD化來調(diào)控泛素降解系統(tǒng)[8-10]。CSN4的蛋白序列所含有的PCI （proteasome-COP9-initiation factor）結(jié)構(gòu)域，可調(diào)節(jié)蛋白酶體的裝配、蛋白質(zhì)之間的相互作用以及植物激素的合成代謝，從而介導(dǎo)植物的抗蟲反應(yīng)[11-14]。

實驗室前期在煙草中成功表達(dá)了ChIFN-γ（chicken interferon gamma）[15]，應(yīng)用煙草全基因組表達(dá)譜芯片，篩選出轉(zhuǎn)基因煙草中的差異表達(dá)基因，通過GO及KEGG Pathway分析篩選與煙草抗蟲相關(guān)的候選基因，推測轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草的抗蟲機制可能主要基于類似JAK-STAT和MAPK的信號途徑調(diào)控下游特異性基因CSN4的表達(dá)引起依賴于JA或SA的植物防御反應(yīng)，最終介導(dǎo)植物的抗病蟲反應(yīng)[12]。有研究表明植物中CSN沉默減少傷口反應(yīng)伴隨著茉莉酸（JA）的合成減少而水楊酸（SA）未改變，并且這些植物表現(xiàn)出對草食性幼蟲和腐殖真菌病原體灰葡萄孢的抗性降低，不僅對植物發(fā)育有影響，而且引起依賴JA植物防御反應(yīng)[14]。……