云南四種普洱茶中微生物的分離純化

晏愛芬+余麗+韓云永

（保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南保山，678000）

摘 要：采用稀釋涂布法從4種普洱熟茶中分離到2株真菌、13株細(xì)菌。2株真菌中，1株為黑曲霉（Aspergillus niger），1株為青霉（Penicillium）；13株細(xì)菌中，有3株為革蘭氏陰性菌，10株為革蘭氏陽性菌。

關(guān)鍵詞：普洱茶 微生物 分離純化

云南普洱茶因其發(fā)酵方式不同，分為熟茶和生茶。熟茶是將鮮葉攤放、殺青、揉捻、日光干燥后，進(jìn)行微生物發(fā)酵、渥堆等人工處理，使茶性溫和、醇香濃厚而制成的茶葉，普洱茶的香味放置時間越長越濃郁。發(fā)酵普洱茶的微生物有真菌和細(xì)菌，其中真菌主要有曲霉屬、根霉屬、青霉屬等，通過研究確定曲霉屬是普洱茶發(fā)酵中的優(yōu)勢菌種，有助于提高普洱茶的熟化速度。本文主要是從市場購買4種不同的普洱熟茶，從中分離真菌和細(xì)菌，初步研究普洱茶中微生物的多樣性。

一、材料與方法

（一）實驗材料

（1）材料：普洱熟茶（昆明紅廟楊馬村）、普洱熟茶（云南普洱茶廠）、普洱磚茶（熟茶、思茅景谷李記谷莊）、陳香普洱（熟）茶（云南隆達(dá)盛茶業(yè)有限公司）。

（2）培養(yǎng)基

馬鈴薯培養(yǎng)基：200g馬鈴薯浸汁，20g葡萄糖，15～20g瓊脂，H2O 1000mL，pH自然。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH7.4～7.6。

（二）實驗方法

1.微生物的分離與純化

（1）制備普洱茶的稀釋液：稱取1.0g的各種普洱茶迅速放入99mL無菌水中，放置于振蕩培養(yǎng)箱中振蕩30min，使茶充分溶解于蒸餾水中，制成10-2倍茶懸液，靜置30min。

（2）接種：將稀釋液取0.1mL接種于表1所示的選擇性平板培養(yǎng)基表面中央，用無菌涂布器將茶懸液在平板上朝相同的方向推移，使其在平板上分布均勻。

（3）菌種分離純化

經(jīng)24小時培養(yǎng)的細(xì)菌單菌接種于無菌培養(yǎng)基，重復(fù)3次得到純化的細(xì)菌菌落。

將5-7天長出的真菌菌落進(jìn)行重復(fù)培養(yǎng)2次，得到純化的真菌菌落。

2.光學(xué)顯微鏡觀察

對培養(yǎng)12～14h的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，并觀察菌體形狀。

真菌菌落長出后，用接種針從平板上挑取少量菌絲體置于載玻片，光學(xué)顯微鏡下觀察其孢子及孢子絲的形態(tài)。

二、實驗結(jié)果

（一）細(xì)菌的菌落形態(tài)特征

通過3次分離純化后，得到13株細(xì)菌，其菌落特征及光學(xué)顯微鏡觀察后，結(jié)果見表2所示。

（二）真菌的菌落特征及顯微觀察

真菌的菌落特征

從表3中可以知道，經(jīng)過4種茶類的接種、分離純化后得到2種真菌，通過菌落形態(tài)及光學(xué)顯微觀察后，這兩種真菌分別是青霉和黑曲霉。

三、結(jié)論

對4種普洱熟茶進(jìn)行分離純化，得到2株真菌、13株細(xì)菌。2株真菌中有一株為青霉，顏色是青褐色，菌落邊緣有白色皺紋；一株是黑曲霉，菌落邊緣有少量絨毛，顏色是黑褐色。

細(xì)菌經(jīng)過革蘭氏染色后，13株細(xì)菌中有10株是革蘭氏陽性菌，3株是革蘭氏陰性菌，形狀都是桿狀。

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作者簡介：晏愛芬（1976-），女，保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，副教授，碩士，研究方向為生物學(xué)的研究。