越鞠丸對帕金森病抑郁模型小鼠的抗抑郁作用研究

唐娟娟 王啟盛 高 瞾 孫夢秋 張 垚 朱 婷 陳 剛

·實驗研究·

越鞠丸對帕金森病抑郁模型小鼠的抗抑郁作用研究

唐娟娟 王啟盛 高 瞾 孫夢秋 張 垚 朱 婷 陳 剛

目的研究越鞠丸對帕金森病抑郁(PDD)模型小鼠的抗抑郁治療效果及其作用機制。

帕金森病抑郁；越鞠丸；突觸可塑性

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是中老年常見的慢性神經退行性疾病, 臨床主要表現為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢異常等運動癥狀, 此外還伴有嗅覺障礙、便秘、抑郁和焦慮等非運動癥狀。其中, 抑郁是PD最常見的非運動癥狀, 影響PD患者的生活質量, 損害患者認知功能及增加經濟負擔, 是影響PD患者治療的重要因素［1］, 大量臨床研究表明帕金森病伴發抑郁(Parkinson’s disease depression, PDD)的發病率超過50%［2］。目前臨床實驗認為選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑和行為干預對PDD有一定療效［3］,但其療效并未得到可靠的評價。越鞠丸始載于元代朱丹溪的《丹溪心法》, 方由蒼術、香附、川芎、神曲、梔子五味藥組成。中醫理論認為越鞠丸專為郁病而設, 重在理氣解郁, 兼顧六郁(汪昂《醫方集解》)。大量研究證實以越鞠丸為基礎方進行的抗抑郁治療效果理想, 例如, 越鞠丸治療中風后抑郁有效率為85.19%［4］；越鞠升降湯治療老年抑郁癥的長期效果與西酞普蘭相當［5］。越鞠丸與度洛西汀聯用, 療效明顯高于單用度洛西汀, 副作用少［6］。本研究制備MPTP亞急性小鼠模型, 從中篩選出PDD小鼠, 考察越鞠丸對帕金森病抑郁的治療作用及相關機制。

1 材料來源

1.1 藥物制備 越鞠丸的制備：香附、川芎、梔子、蒼術、神曲(由南京國醫堂門診部藥房購入), 每味藥200 g打粉,過100目篩混勻, 室溫浸于10倍量 95%乙醇中24 h, 收集浸出液, 重復2次。浸出液過濾后, 以55℃條件下減壓濃縮,收集濃縮后浸膏48.4 g。MPTP購于Sigma公司。

1.2 動物來源 清潔級健康成年雄性Balb/c小鼠32只,體質量18～24 g, 軍事醫學科學院提供, 動物合格證號：2007000581303。適應性飼養1周后用于實驗。動物房室溫25℃, 濕度45%, 明暗交替時間為12 h, 動物可自由飲食進水。

1.3 儀器 強迫游泳視頻分析系統(上海吉量軟件公司),旋轉蒸發儀(河南鞏義予華儀器設備有限公司)。

2 方法及結果

2.1 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2.2 帕金森病抑郁小鼠模型的建立 MPTP模型是經典的小鼠PD模型。MPTP模型誘導小鼠DA神經元丟失, 運動障礙的同時, 可誘導66.7% C57/b6小鼠出現抑郁樣行為, 表現為懸尾實驗和強迫游泳實驗中不動時間顯著延長, 糖水偏好減少［7］。本實驗中, 腹腔注射MPTP (30 mg/kg×5 d) 制備帕金森病亞急性模型, 等量生理鹽水腹腔注射作為對照, 每組10只, 末次給藥后7 d觀察小鼠神經行為學指標, 從中篩選出PDD小鼠進行后續實驗。

2.3 越鞠丸對帕金森病抑郁模型小鼠自主活動的影響 開場實驗(OPT)是用于評價實驗動物在新異環境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。將動物放入箱內(40 cm×40 cm ×35 cm)底面中心, 同時進行攝像和計時。記錄在5 min內的總活動路程和在中央區域的活動時間, 行為分析采用ANY-maze軟件。爬桿實驗(The pole test)是評價帕金森病模型小鼠運動功能常用方法之一, 在長50 cm、直徑1 cm的垂直木桿頂端放一木塞, 將小鼠放在木塞上, 記錄小鼠開始自動向下爬行的時間以及爬桿總時間。結果顯示：開場實驗中, MPTP造模以及越鞠丸11 g/kg單次給藥后, 小鼠活動總路程以及在中央區停留的時間比較差異均無統計學意義(P＞0.05);而爬桿實驗中, MPTP造模后, 小鼠開始向下爬行時間以及爬桿總時間均延長(P＜0.05或0.01), 越鞠丸單次給藥對其無顯著影響(P＞0.05)。見圖1。結果表明：越鞠丸對帕金森病抑郁模型小鼠自主活動及運動功能無顯著影響。

圖1 越鞠丸對帕金森病抑郁模型小鼠開場實驗和爬桿實驗中活動的影響

2.4 越鞠丸改善帕金森病抑郁模型小鼠抑郁樣行為 懸尾實驗(TST)用于反映動物的行為絕望。在距尾尖1 cm的部位用膠帶將小鼠倒掛于橫置的鐵桿(直徑約1 cm)上, 小鼠頭部距離地面高度約30 cm。強迫游泳實驗(FST)用于反映動物的行為絕望。實驗前小鼠訓練游泳15 min, 24 h后測試。

將小鼠放入水深15 cm的玻璃缸內, 水溫25℃。兩者均應用DepressionScan記錄6 min內小鼠的運動狀態, 測量后4 min內小鼠軀體及四肢不動的時間。糖水偏愛實驗(SPT)用于反映抑郁癥動物快感缺失癥狀。將分別裝有蒸餾水和1%蔗糖水溶液的水瓶放于鼠籠上。記錄10 h內小鼠攝入蒸餾水及糖水的量, 計算糖水偏愛率(糖水攝入量與總攝水量的比值)。結果顯示：與對照組相比, MPTP模型組小鼠強迫游泳不動時間無明顯變化(P＞0.05), 懸尾實驗不動時間顯著延長(P＜0.05), 糖水偏愛降低(P＜0.05)；越鞠丸單次給藥后, 對小鼠強迫游泳不動時間無影響(P＞0.05), 顯著降低懸尾不動時間(P＜0.05), 并且增加小鼠糖水攝入量(P＜0.05)。見圖2。

結果表明：越鞠丸能夠改善帕金森病抑郁模型小鼠的抑郁樣行為。

圖2 越鞠丸對帕金森病抑郁模型小鼠強迫游泳、懸尾不動時間和糖水偏愛的影響

2.5 越鞠丸增加帕金森病抑郁模型小鼠前額皮層突觸可塑性蛋白的表達 PSD-95是谷氨酸能神經元突觸后致密蛋白家族中的一種膜相關蛋白, 在突觸可塑性信號轉導中發揮重要作用。Synapsin-1是調節突觸結構和功能的關鍵前膜囊泡蛋白。GluR-1是AMPA受體的一種亞型, 而突觸后膜上AMPA受體數量的變化可能是突觸可塑性的機制之一。在抑郁癥等諸多神經精神疾病中, 突觸相關PSD-95, Synapsin-1和GluR-1等均會出現表達異常。結果顯示：與對照組相比, MPTP模型組小鼠前額皮層PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白表達顯著下調(P＜0.01或0.05), 越鞠丸單次給藥后, 這些突觸可塑性相關蛋白表達顯著增加(P＜0.05), 而越鞠丸對小鼠前額皮層PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白的基礎表達水平無顯著影響(P＞0.05)。見圖3。結果表明：越鞠丸能夠增強帕金森病抑郁模型小鼠前額皮層的突觸可塑性。

圖3 越鞠丸對帕金森病抑郁模型小鼠前額皮層突觸蛋白表達的影響

3 討論

臨床研究表明PDD患者部分繼發于運動障礙或者藥物治療, 也有部分患者抑郁癥狀先于運動癥狀出現, 并且PDD的病理過程與運動癥狀的病理進程并不平行, 患者抑郁的嚴重程度與黑質多巴胺能神經元變性, 皮層紋狀體環路功能障礙相關。說明 PDD 的發生有其神經生化及病理基礎［8］。本實驗室前期研究表明, 處于抑郁狀態時, mPFC區萎縮, 神經元樹突棘減少, 突觸可塑性降低［9］。抗抑郁藥能夠通過增加mPFC腦源性神經營養因子(BDNF)釋放, 激活蛋白激酶B和胞外信號調節激酶通路, 進而激活下游mTOR信號通路, 促進突觸發生, 增強突觸可塑性功能, 發揮抗抑郁作用［10］。

本研究中, 首次發現：①越鞠丸對帕金森病抑郁模型(經典MPTP亞急性模型)小鼠自主活動和運動功能無明顯改善作用；②越鞠丸顯著改善帕金森病抑郁模型小鼠的抑郁樣行為；③越鞠丸顯著上調帕金森病抑郁模型小鼠前額皮層突觸可塑性相關蛋白的表達水平。因此推測越鞠丸治療帕金森病抑郁的作用機制可能是通過增加前額皮層突觸可塑性蛋白的含量。并且, 作者前期研究發現越鞠丸通過下調NMDA受體NR1以及增強Akt/mTOR信號通路改善CUMS(慢性不可預知應激模型)小鼠的抑郁樣行為, 發揮抗抑郁的作用。

帕金森病抑郁近年來愈發引起臨床關注, 越鞠丸功用行氣解郁, 臨床常用于郁證的治療。本研究在前期研究基礎上,深化了對PDD病理機制的認識, 可能與前額皮層突觸可塑性降低相關, 并進一步拓寬了越鞠丸的應用范圍, 為臨床應用越鞠丸治療帕金森病抑郁提供了有力證據。

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［10］ Tang J, Xue W, Xia B, et al.Involvement of normalized NMDA receptor and mTOR-related signaling in rapid antidepressant effects of Yueju and ketamine on chronically stressed mice.Scientific Reports, 2015, 5(5):13573.

Research of anti-depression effect by Yueju pills for mice in Parkinson’s disease depression model

TANG Juan-juan, WANG Qi-sheng, GAO Zhao, et al.Department of Physiology, School of Medicine and Life Sciences of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

ObjectiveTo research anti-depression effect by Yueju pills for mice in Parkinson’s disease depression (PDD) model, and its mechanism of action.MethodsA total of 32 clean and healthy male adult Balb/ c mice were randomly divided into control group and MPTP (1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine) subacute model group.Mice with depression manifestation in the model group were given single lavage by 11 g/ kg of Yueju pills.Anti-depression effect by Yueju pills for PDD mice was observed by forced swimming test, tail suspension test and sugar water preference test.Influence by Yueju pills on prefrontal cortex synaptic protein PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 levels in PDD mice was researched.ResultsAfter MPTP modeling and single administration by 11 g/kg of Yueju pills in open field test, there was no statistically significant difference of total distance in activity and duration of stay at central area (P＞0.05).After MPTP modeling in pole-climbing test, climbing down time and total pole-climbing time were all prolonged (P＜0.05 or 0.01), while single administration of Yueju pills showed no influence (P＞0.05).Comparing with the control group, MPTP model group had no obvious change in immobility time during forced swimming test (P＞0.05), obviously prolonged immobility time during tail suspension test (P＜0.05) and lowered sugar water preference (P＜0.05).Single administration of Yueju pills showed no influence on immobility time during forced swimming test (P＞0.05), but it remarkably prolonged immobility time during tail suspension test (P＜0.05), and increased sugar water intake volume (P＜0.05).Comparing with the control group, MPTP model group had obviously lowered prefrontal cortex PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 protein expression (P＜0.01 or 0.05).Single administration of Yueju pills led to obviously increased synaptic plasticity-related protein (P＜0.05), while it had no remarkable influence on prefrontal cortex PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 protein expression (P＞0.05).ConclusionYueju pills shows excellent anti-depression effect for micein Parkinson’s disease depression model.Its mechanism may have correlation with increased synaptic plasticityrelated protein as prefrontal cortex PSD-95, Synapsin-1 and GluR-1 protein expression in PDD mice.

Parkinson’s disease depression; Yueju pills; Synaptic plasticity

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.07.099

2017-02-24］

江蘇省自然科學青年基金(項目編號：BK20161044)；國家自然科學青年基金(項目編號：81603089)

210023 南京中醫藥大學醫學與生命科學院生理學系

唐娟娟

方法清潔級健康成年雄性Balb/c小鼠32只, 隨機分為對照組和MPTP(1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶)亞急性模型組, 模型組中篩選出抑郁樣表型小鼠, 單次灌胃給予越鞠丸11 g/kg, 通過強迫游泳, 懸尾以及糖水偏愛實驗觀察越鞠丸對PDD小鼠的抗抑郁治療作用, 并考察越鞠丸對PDD小鼠前額皮層突觸蛋白PSD-95, Synapsin-1和GluR-1水平的影響。結果開場實驗中, MPTP造模以及越鞠丸11 g/kg單次給藥后, 小鼠活動總路程以及在中央區停留的時間比較差異均無統計學意義(P＞0.05);而爬桿實驗中, MPTP造模后, 小鼠開始向下爬行時間以及爬桿總時間均延長(P＜0.05或0.01), 越鞠丸單次給藥對其無顯著影響(P＞0.05)。與對照組相比, MPTP模型組小鼠強迫游泳不動時間無明顯變化(P＞0.05),懸尾實驗不動時間顯著延長(P＜0.05), 糖水偏愛降低(P＜0.05)；越鞠丸單次給藥后, 對小鼠強迫游泳不動時間無影響(P＞0.05), 顯著降低懸尾不動時間(P＜0.05), 并且增加小鼠糖水攝入量(P＜0.05)。與對照組相比, MPTP模型組小鼠前額皮層PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白表達顯著下調(P＜0.01或0.05), 越鞠丸單次給藥后, 這些突觸可塑性相關蛋白表達顯著增加(P＜0.05), 而越鞠丸對小鼠前額皮層PSD-95, Synapsin-1和GluR-1蛋白的基礎表達水平無顯著影響(P＞0.05)。結論越鞠丸對帕金森病抑郁模型小鼠具有顯著抗抑郁樣作用, 其機制可能與越鞠丸增加PDD小鼠前額皮層突觸可塑性相關蛋白PSD-95, Synapsin-1和GluR-1的表達有關。