新疆阿魏菇細菌性斑點病病原菌的鑒定

羅影，關永強，賈培松，努爾孜亞·亞力買買提，郝敬喆，賈文捷，魏鵬

(1. 農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/新疆農業科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002)

新疆阿魏菇細菌性斑點病病原菌的鑒定

羅影1，關永強2，賈培松1，努爾孜亞·亞力買買提1，郝敬喆1，賈文捷1，魏鵬1

(1. 農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/新疆農業科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002)

【目的】研究新疆地區阿魏菇細菌性斑點病的病原菌。【方法】應用菌落特征、致病性測定、16S rDNA序列測定、序列同源性比較，及生理生化反應特征，對阿魏菇細菌性斑點病病原菌分離物進行鑒定。【結果】從阿魏菇子實體病害樣品中分離到19個單菌落分離物，并對該19個分離物進行致病性檢測，其中有8個分離物在健康阿魏菇子實體上產生了細菌性斑點病癥狀，通過16S rDNA序列比對、序列同源性比較和生理生化反應分析，該8個分離物均為假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)。【結論】新疆地區阿魏菇細菌斑點病由假單胞桿菌 (Pseudomonasspp.)引起。

阿魏菇；細菌性斑點病；形態學鑒定；分子生物學鑒定；假單胞桿菌

0 引 言

【研究意義】阿魏菇(Pleurotus. Eryngii var. ferulae)又名阿魏側耳、阿魏蘑、西天白靈芝等，具有優良的食用和藥用價值，是新疆地區特有的一種珍稀食用菌資源[1]。細菌性斑點病(Bacterial spot disease)又稱細菌性褐斑病、銹斑病，是一種發生在菌蓋表面的細菌性斑點病，主要表現為發生在菌蓋表面不規則和褐色斑點，有時也表現為褐色凹陷斑。其危害性極大，一旦發生，傳播迅速，很難徹底防治，并且會逐年加重[2]，給菇農造成嚴重的經濟損失。主要危害平菇和雙孢蘑菇，在杏鮑菇、香菇、金針菇等食用菌上也有報道[3]，而關于阿魏菇細菌性斑點病的報道很少。因此，研究阿魏菇細菌斑點病的發病原因及病原菌鑒定，對開發利用阿魏菇種質資源和研發抗性菌種都具有重要的意義。【前人研究進展】近年來隨著新疆阿魏菇栽培規模不斷擴大，褐斑病的發病率及發病程度越來越嚴重，如努爾孜亞等[4]于2011年4～6月在新疆的哈巴河縣、烏魯木齊縣南山板房溝鄉等地的菇棚內調查發現在平菇和阿魏菇上都相繼出現了細菌性斑點性病變，但并沒有理想的防治措施；張瑞穎[2]和金丹[5]采用16s rDNA序列測定及序列同源性比較的方法，均鑒定出了平菇褐斑病病原菌為托拉斯假單胞桿菌(Pseudomonastolaasii)，表明采用16S rDNA序列分析方法鑒定食用菌致病病原菌的可行性。【本研究切入點】有關新疆地區阿魏菇細菌性褐斑病病原菌分類及鑒定的研究未見文獻報道。研究通過病原菌16S rDNA序列測定以及序列同源性比較，結合病原菌落特征、菌體形態觀察和革蘭氏染色反應等方法，對引起新疆地區阿魏菇細菌斑點病的病原菌進行分類鑒定。【擬解決的關鍵問題】研究鑒定出的致病病原菌的種屬關系，為阿魏菇在實際生產中的病害防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

患病的阿魏菇子實體分別采自烏魯木齊縣板房溝和阿勒泰地區青河縣，致病性測定所用健康子實體購自烏魯木齊市北園春市場。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離純化

采用常規分離方法進行[2]，先用75%酒精對病菇表面消毒，再用無菌水沖洗2～3次，置于無菌玻璃皿中，于病健交界處取約5 mm2病斑組織3～5塊，同一病斑的病斑組織塊置于同一LB平板中。平板置于25℃恒溫培養箱內培養，每天觀察病菌生長情況，2～3 d后觀察菌落生長情況，并純化保存。

1.2.2 致病性測定

致病性檢測常采用點蝕測試評估方法(spotting-test)[6]，即將細菌菌懸液接種到健康蘑菇菌蓋表面，觀察是否形成侵染抑制病斑。以健康的阿魏菇子實體作為病原菌致病性檢測的供試材料，挑取單菌落于LB液體培養基中振蕩培養16～18 h，取健康阿魏菇子實體，表面用75%酒精消毒，以霧狀噴灑在阿魏菇子實體上，以無菌水作對照試驗，每組設3個重復，放入鋪有保濕紙的塑料盒內，于恒溫培養箱25℃培養觀察。

1.2.3 分子生物學鑒定

待測分離物在LB液體培養基培養24 h，用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取分離物的細菌總DNA。利用細菌16S rDNA的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1 492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μL)：引物27F和1 492R各1 μL，Taq酶1 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延長1 min，35個循環，72℃10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進行純化。

將純化后的產物交由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司進行測序。測序結果利用DNAstar軟件進行拼接，后提交至NCBI核酸數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，進行BLAST比對分析。分別選取與各個菌株相似性較高的細菌16S rDNA序列，進行系統進化分析，利用MEGA6.0軟件首先進行多重序列比對，再采用Neighbour-joining法構建系統發育樹，進行1 000次Bootstrap自舉法檢驗[5]。

1.2.4 形態學鑒定

參照東秀珠等[7]編著的《常見細菌系統鑒定手冊》中的方法進行，對各菌株的生長溫度、接觸酶、氧化酶等生理生化特征進行測定，并依照《伯杰細菌鑒定手冊》[8]進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 患病子實體的癥狀

研究表明，細菌性斑點病在阿魏菇生長的任何時期都有發現，且病原菌一般侵染阿魏菇子實體的表面組織，多為菌蓋被感染。如果在子實體早期發育階段感染病原菌，會導致子實體發育緩慢或畸形，甚至停止發育，子實體萎蔫死亡。成熟子實體被侵染后，菌蓋表面病斑或呈點狀或塊狀分布，呈現圓形或近圓形黃褐色凹陷斑；或呈片狀分布，條件適宜時病斑蔓延至整個子實體，且凹陷斑表面會出現一層粘性菌膿，并迅速腐爛發出臭味，嚴重影響阿魏菇的產量。若及時菇棚內控制溫度和濕度，可有效控制患病的范圍和程度，但已產生的病斑不會消散，影響阿魏菇的品質。圖1

圖1 阿魏菇細菌性斑點病的癥狀
Fig.1 Disease symptoms of thePleurotus. Eryngii var. ferulae

2.2 病原菌的分離純化與致病性檢測

在新疆阿魏菇主栽區烏魯木齊縣和青河縣共計采集阿魏菇病樣14個，分離出19個單菌落。分別將該19個分離物回接至健康的阿魏菇子實體，引起病斑反應，即有致病性的分離物有8個：BD2、BD3、BD13、BD14、BD15、BD18、BD19和BD20。人工感染的阿魏菇子實體，約48 h后出現病斑，72 h后整個子實體開始發臭發粘，與大田發病癥狀基本相同，而陰性對照無明顯反應，且從再次接種后發病子實體上分離到與接種菌株菌落形態相同的菌株。表1

表1 菌株來源、菌落形態及致病性檢測
Table 1 Origin of stains, colony morphologies and pathogenecitiestest

采集病樣Samples純化菌株Purifiedstrains來源Origin菌落形態特征Colonymorphologies致病性檢測PathogenecitytestAW-1BD1青河縣淡黃色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-AW-2BD2青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-3BD3青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-4BD4烏魯木齊縣乳白色,不規則形狀,邊緣不整齊,表面粗糙,無光澤-AW-4BD5烏魯木齊縣乳白色,不規則形狀,邊緣不整齊,表面粗糙,無光澤-AW-5BD6烏魯木齊縣黃色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-AW-5BD7烏魯木齊縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-AW-6BD8烏魯木齊縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-7BD10烏魯木齊縣乳白色,不規則形狀,邊緣不整齊,表面粗糙,無光澤-SF-1BD11烏魯木齊縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面粗糙,無光澤-SF-2BD12烏魯木齊縣白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-SF-3BD13烏魯木齊縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-11BD14青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-12BD15青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-12BD16青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-AW-13BD17青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤-AW-13BD18青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-14BD19青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+AW-14BD20青河縣乳白色,圓形,邊緣整齊,表面光滑,隆起,有光澤+

注："+"有致病性，"-"無致病性

Note: "+" Pathogenicity, "-" No pathogenicity

2.3 分子生物學鑒定

提取8個分離物的全基因組DNA，用16S rDNA基因通用引物27F/1492R擴增8個分離物的基因組DNA，電泳檢測其分子量均約為1 500 bp，其分子量大小與理論值相符。基因測序后，分別將8個分離物的16S rDNA序列在NCBI上進行Blast比對分析，研究表明，與這8個分離物同源性高達99%的均屬于假單胞桿菌屬(Pseudomonas)。 圖2

選擇這些種屬關系較明確的菌株，并從LPSN(www.bacterio.net/bacillus.html)上下載該菌的模式菌株的16S rDNA序列，與8個分離物的16S rDNA序列一起，用Mega6.0中Neighbor-joining 法進行1 000次Bootstrap自舉法檢驗構建系統發育樹。8個分離物BD2、BD3、BD13、BD14、BD15、BD18、BD19和BD20可確定為Pseudomonassp.；且BD3和BD20、BD14和BD19的進化距離很小，且自舉值>50%，這說明它們可能為同一種菌或親緣關系較近。 圖3

圖2 8個分離物的16S rDNA基因擴增結果
Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA of 8 pathogenic bacteria

圖3 基于16S rDNA序列的系統發育樹
Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence表2 8個分離物的生理生化特征
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of 10 pathogenic bacteria

項目Items菌株 StrainsBD2BD3BD13BD14BD15BD18BD19BD20革蘭氏染色(Gramstain)--------乙醇產酸(Useofethanoltoaceticacid)--------D-甘露醇產酸(UseofD-mannitoltoacid)--------反硝化(Denitrification)--------氧化酶(Oxidase)++++++++接觸酶(Hydrogenperoxidase)++++++++硝酸鹽還原(Nitratereduction)++++++++甲基紅測定(Methylredtest)--------V-P測定(Voges-Proskauer)--------吲哚(Indole)--------明膠液化(Gelatinliquefaction)++++++++丙二酸利用(Useofmalonate)++++++++淀粉水解(Starchhydrolysis)--------賴氨酸脫羧酶(Lysinedecarboxylase)--------鳥氨酸脫羧酶(Ornithinedecarboxylase)--------苯丙氨酸脫氨酶(Phenylalaninedeamination)--------精氨酸雙水解酶(Argininedihydrolase)++++++++生長:4℃(4℃tolerance)++++++++41℃(41℃tolerance)----++--60℃(60℃tolerance)--------

注：“+/-”分別表示生理生化反應的陽性和陰性

Note: "+/-" indicates positive and negative of these physiological and biochemical tests, respectively

2.4 形態學鑒定

研究表明，8個分離物均為革蘭氏陰性菌，均不能在60℃下生長，不能氧化乙醇和甘露醇產酸，不能進行反硝化作用，能夠產生氧化酶和接觸酶，能夠還原硝酸鹽，甲基紅和V-P測定皆為陰性，不產生吲哚等特征，均符合《伯杰細菌鑒定手冊》[7]中好氧革蘭氏陰性桿菌檢索表中對假單胞菌屬的檢索。表2

3 討 論

彭煒等報道侵染性細菌病害的病原菌主要為假單胞桿菌屬(Pseudomonas)和歐文氏菌屬(Erwinia)，而侵染性細菌病害主要為細菌性褐斑病[9]。回接病原菌的阿魏菇子實體，初期為小的黃褐色的斑點，逐步發展成為大片黃褐色斑塊，最后整個菇體腐爛變質。其菌落形態大多為米白色，圓形，邊緣整齊，光滑，飽滿，有光澤。經檢測8株菌均為革蘭氏陰性菌，氧化酶和接觸酶反應均呈陽性甲基紅和V-P反應呈陰性。根據菌落形態、革蘭氏染色法與16S rDNA序列測定以及序列同源性比較得出致病菌菌株BD2、BD3、BD13、BD14、BD15、BD18、BD19和BD20均屬于假單胞桿菌屬 (Pseudomonas )，但無法確定具體種。據調查，未見有新疆地區阿魏菇致病性病原菌的分析鑒定的相關報道，研究首次確定出新疆地區阿魏菇致病性病原菌為假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)。

根據1993年Palleroni對假單胞菌屬的分類[10]，假單胞菌屬包括20個種59個致病變種，而事實上該屬成員眾多，是一個異質性很強的屬。研究得出8株致病病原菌均屬于假單胞桿菌屬(Pseudomonas)，而可能為不同種。針對阿魏菇致病性病原菌分類，開展更深層次的研究，獲得更為詳細的分類標準，為阿魏菇細菌性斑點病的科學防治提供依據，將是該領域未來研究的重點。

4 結 論

從新疆阿魏菇主栽區烏魯木齊縣和青河縣采集阿魏菇細菌性斑點病病菇，分離到細菌性分離物，經致病性測定、形態學鑒定包括其各類生理生化反應和分子生物學輔助(16S rDNA序列比對和同源性比較)鑒定出病原菌為假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)。病原菌的確定為阿魏菇在實際生產中的病害防控提供了理論依據。

References)

[1] 戴玉成,周麗偉,楊祝良,等.中國食用菌名錄[J].菌物學報, 2010, (29): 1-21.

DAI Yu-cheng, ZHOU Li-wei, YANG Zhu-liang, et al. (2010). A revised checklist of edible fungi in China [J].Mycosystema, (29): (1): 1-21.

[2] 張瑞穎,左雪梅,姜瑞波,等.平菇褐斑病病原菌的分離與鑒定[J].中國食用菌,2007,26(5): 58-60.

ZHANG Rui-ying, ZUO Xue-mei, JIANG Rui-bo, et al. (2007). Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria Caused Brown Blotch Disease of Oyster mushroom [J].EdibleFungiofChina, 26(5): 58-60. (in Chinese)

[3] 張瑞穎,胡丹丹,左雪梅,等.平菇和雙孢菇細菌性褐斑病研究進展[J].植物保護學報,2007,34(5): 549-554.

ZHANG Rui-ying, HU Dan-dan, ZUO Xue-mei, et al. (2007). Research advancement on brown blotch disease of oyster mushroom and button mushroom [J].ActaPhytophylacicaSinica, 34(5): 549-554. (in Chinese)

[4] 努爾孜亞,郝敬喆,魏鵬,等.北疆地區食用菌細菌性褐斑病診斷與防治藥劑篩選[J].新疆農業科學,2012,49(12):2 234-2 238.

Nuerziya, HAO Jing-zhe,WEI Peng, et al. (2012). Occurrence and Identification of Bacterial Brown Patch of Processing Mushrooms in Nortnern Xinjiang [J].XinjiangAgriculturalSciences, 49(12): 2,234-2238. (in Chinese)

[5] 金丹,李寶聚,石延霞,等.一種平菇褐斑病病原菌的鑒定[J].食用菌學報,2009,16(1):89-91.

JIN Dan, LI Bao-ju, SHI Yan-xia, et al. (2009). Identification of a pathogenic bacteria caused brown blotch disease of oyster mushroom [J].ActaEdulisFungi, 16(1): 89-91. (in Chinese)

[6] Yun, Y. B., Park, S. W., Cha, J. S., & Kim, Y. K. (2013). Biological characterization of various strains of pseudomonas tolaasii, that causes brown blotch disease.AppliedBiologicalChemistry, 56(1):41-45.

[7] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[K].北京：科學出版社,2001: 353-398.

DONG Xiu-zhu, CAI Miao-ying. (2001).Handbookofcommonbacterialsystemidentification[K]. Beijing: Science Press: 353-398. (in Chinese)

[8] R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等. 伯杰細菌鑒定手冊(第八版) [K].北京：科學出版社,1984:128-171.

R.E.Buchanan, N.E. Gibbons, et al. (1984).Bergey'smanualofsystematicbacteriology[K]. Beijing: Science Press: 128-171. (in Chinese)

[9] 王晶.食用菌病害的調查與新病害病原菌鑒定研究[D]. 沈陽: 沈陽農業大學碩士論文,2010.

WANG Jing. (2010).Thesurveyofthemushroomdiseasesandtheidentificationofnewoccurringdiseasespathogens[D]. Master Dissertation. Shenyang Agricultural University，Shenyang. (in Chinese)

[10] 郭亞輝,郭堅華,李斌.根據16S rRNA序列對假單胞菌屬分類學的研究進展[J].微生物學雜志,2004,24(2):38-41.

GUO Ya-hui, GUO Jian-hua, LI Bin. (2004). Advance of Taxon of Pseudomonas Based on 16S rRNA Sequence [J].JournalofMicrobiology, 24(2):38-41. (in Chinese)

Supported by: China Agriculture Research System Program (No.CARS24)；Open Fund of Key Laboratory of Integrated Management of Harmful Crop Vermin in China North-western Desert Oasis "The investigation and identification of bacterial spot disease and pathogen on Pleurotus ferulae in Xinjiang" (No.KFJJ20150105)

WEI Peng(1961-), male, Edible fungi cultivation research

Identification of Pathogens Causing Bacterial Spot Disease onPleurotusFerulae (Pleurotus. Eryngii var. ferulae) in Xinjiang

LUO Ying1，GUAN Yong-qiang2，JIA Pei-song1，Nerziya Yalimaimaiti1， HAO Jing-zhe1，JIA Wen-jie1，WEI Peng1

(1.KeyLaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCropVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.XinjiangResearchInstitutesofTraditionalChineseMateriaMedicaandEthnodrug,Urumqi830002,China)

【Objective】 The objective of this study is to identify the pathogens that cause bacterial spot disease ofPleurotusferulae in Xinjiang. 【Method】The causal agents were identified by colony characterization, pathogenicity test, 16S rDNA sequence analyses, sequence homology comparison, and biochemical characterization tests. 【Result】Nineteen bacterial isolates were isolated from diseased samples ofPleurotusferulae. Through pathogenicity test, eight tested isolates caused typical symptoms of bacterial spot disease on the healthy fruiting bodies ofPleurotusferulae. Based on pathogenicity test, and combined with the results of 16S rDNA sequence analyses, sequence homology comparison, biochemical and molecular characterization, eight isolates were identified asPseudomonasspp. 【Conclusion】The bacterial spot disease onPleurotusferulae in Xinjiang is incited byPseudomonasspp.

Pleurotus. eryngii var. ferulae; bacterial spot disease; morphological identification; molecular biological identification;Pseudomonas

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.03.016

2016-11-24

國家現代農業產業技術體系項目(CARS24)；農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室開放基金“新疆阿魏菇細菌性斑點病的調查與病原菌鑒定研究”(KFJJ20150105)

羅影(1988-)，女，碩士研究生，助理研究員，研究方向為食用菌育種，(E-mail)ly19880219@126.com

魏鵬(1961-)，男，新疆人，高級農藝師，研究方向為食用菌栽培，(E-mail)xjzbswp@126.com

S435.673

A

1001-4330(2017)03-0513-07