新疆主要小麥品種(系)中抗條銹病基因的分子檢測(cè)

白微微，高海峰，張航，雷鈞杰，高永紅，劉恩良，李廣闊

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，烏魯木齊 830091)

新疆主要小麥品種(系)中抗條銹病基因的分子檢測(cè)

白微微1，高海峰1，張航1，雷鈞杰2，高永紅2，劉恩良2，李廣闊1

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，烏魯木齊 830091)

【目的】選用抗條銹病基因Yr10和1BL/1RS易位的分子標(biāo)記，明確抗條銹病基因Yr10和1BL/1RS易位在新疆小麥品種(系)中的分布，為新疆小麥抗條銹病品種的合理布局及抗性材料的選育提供理論依據(jù)。【方法】利用Yr10及1BL/1RS易位的分子標(biāo)記，檢測(cè)其在新疆麥區(qū)46份小麥材料中的分布。【結(jié)果】在46份供試材料中，新冬17號(hào)檢測(cè)到Y(jié)r10基因的存在；新冬24號(hào)、新冬46號(hào)、MJ307、HMJ555、1112、新紫1號(hào)、983-S、新麥211和新麥23檢測(cè)到1BL/1RS易位，占全部材料的19.57%。【結(jié)論】對(duì)當(dāng)前小麥條銹病流行小種條中32號(hào)具有較好抗性的Yr10基因，在新疆麥區(qū)小麥主栽品種(系)中分布率很低，可能含有Yr10基因的新冬17號(hào)在選育抗病材料中具有一定價(jià)值，育種中應(yīng)加強(qiáng)基因Yr10的利用；在選育新品種時(shí)需減少1BL/1RS易位的分布頻率。

小麥；條銹病；分子標(biāo)記；抗病基因

0 引 言

【研究意義】小麥條銹病(病原菌Pucciniastriiformisf. sp.tritici)是危害世界小麥生產(chǎn)的主要流行病害之一，大發(fā)生年份可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)40%以上，甚至絕收。中國(guó)是世界上小麥條銹病發(fā)生面積最大、危害損失最重的國(guó)家，病害發(fā)生流行規(guī)律比其它國(guó)家更加復(fù)雜多變，自成獨(dú)立的流行體系[1]。小麥條銹病也是新疆小麥的主要發(fā)生病害之一，由于獨(dú)特的地理屏障、氣候條件和小麥種植環(huán)境，新疆被列為全國(guó)小麥條銹病流行區(qū)劃中相對(duì)獨(dú)立的區(qū)系[2]。隨著近年來(lái)氣候變化、種植方式及部分主栽品種抗病性喪失等多種因素的影響，使得新疆小麥條銹病發(fā)生較重，嚴(yán)重威脅著小麥的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)[3]。選育和推廣種植抗病品種是防治小麥條銹病最為經(jīng)濟(jì)有效的技術(shù)措施，而品種的抗病性主要取決于其是否含有抗性基因。分子標(biāo)記技術(shù)因具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點(diǎn)近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于抗病基因的鑒定工作中。因此，通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)篩選和檢測(cè)小麥品種(系)抗性基因，明確新疆麥區(qū)主栽品種和高代品系的抗病性，對(duì)開(kāi)展抗病育種、品種的合理利用及布局都具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】據(jù)報(bào)道只有Yr5、Yr10、Yr15、Yr26等少數(shù)抗條銹基因還保持著對(duì)小麥條銹菌強(qiáng)優(yōu)勢(shì)流行小種條中30號(hào)、31號(hào)、32號(hào)的抗性[4-5]，新疆條銹病生理小種目前主要以條中32號(hào)為主[3]，相關(guān)研究通過(guò)對(duì)甘肅、青海、新疆、西藏四省的小麥條銹菌毒性頻率分析發(fā)現(xiàn)新疆菌株對(duì)Yr10的毒性頻率在1%以下[6]。薛文波[7]、邵映田[8]、李峰奇[9]、伍玲[10]、王欣[11]等先后利用分子標(biāo)記對(duì)中國(guó)青海、陜西、河南、河北、陜西等地的小麥種質(zhì)資源進(jìn)行了抗條銹病基因Yr10、1BL/1RS易位的分子檢測(cè)。目前對(duì)于其它抗條銹病基因如Yr2[12]、Yr5[13-14]、Yr15[15]、Yr24[16]等都有緊密連鎖的標(biāo)記也已被開(kāi)發(fā)，并廣泛使用。【本研究切入點(diǎn)】研究以新疆小麥生產(chǎn)品種、區(qū)試品系及高代品系(共計(jì)46份)為試驗(yàn)材料，利用小麥Yr10和1BL/1RS易位的分子標(biāo)記對(duì)所有材料進(jìn)行檢測(cè)，明確其是否含有抗病基因。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)分子標(biāo)記檢測(cè)，評(píng)估Yr10基因和1BL/1RS易位在新疆栽培小麥品種(系)中的分布情況，為新疆小麥栽培品種布局及抗性材料的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試小麥生產(chǎn)品種、區(qū)試品系及高代品系，共46份，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所、核技術(shù)生物技術(shù)研究所和農(nóng)作物品種資源研究所提供。陽(yáng)性對(duì)照材料‘Avocet S*6/Yr10’以及攜帶1BL/1RS易位的‘洛夫林10號(hào)’由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，陰性對(duì)照材料‘Avocet S’由西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 引物序列合成

用于檢測(cè)Yr10和1BL/1RS易位的分子標(biāo)記引物均由上海生工生物工程有限公司合成。表1

1.2.2 基因組DNA的提取

小麥種子在室溫發(fā)芽后剪取幼葉，重量約0.3 g，采用改良的CTAB法提取小麥葉片DNA[17]。在測(cè)定DNA濃度及檢測(cè)質(zhì)量后，稀釋至工作濃度300 ng/μL。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含12.5 μL 2×EcoTaqPCR SuperMix，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA(300 ng/μL)1 μL，ddH2O 9.5 μL。Yr10的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，64℃退火45s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1BL/1RS的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

表1 引物序列
Table 1 Primer sequences

目標(biāo)基因Targetgene引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')退火溫度(℃)Annealingtemperature參考文獻(xiàn)Reference1BL/1RSAF1GGAGACATCATGAAACATTTGAF4CTGTTGTTGGGCAGAAAG60[18]Yr10Yr10FTCAAAGACATCAAGAGCCGCYr10RTGGCCTACATGAACTCTGGATYr10F1TTGGAATTGGCGACAAGCGTYr10R1GTGATGATTACCCACTTCCTC6464[19-20]

2 結(jié)果與分析

2.1Yr10基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

根據(jù)Zeng等的研究結(jié)果，Yr10的兩個(gè)分子標(biāo)記在含有Yr10基因的品種上能分別擴(kuò)增出543 bp和755 bp的特異性條帶[19-20]，研究利用這兩對(duì)標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以Yr10的單基因系材料Avocet S*6/Yr10為陽(yáng)性對(duì)照，Avocet S，銘賢169為陰性對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果表明，46份材料中，只有新冬17號(hào)能同時(shí)檢測(cè)到兩個(gè)標(biāo)記存在，與陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果一致，據(jù)此推測(cè)該品種含有Yr10基因。圖1，表2

M：100 bp；1：Avocet S*6/Yr10；2：Avocet S；3：1229；4：1309；5：新春12號(hào)；6：新春34號(hào)；7：新春15號(hào)； 8：1245；9：1354；10：366S；11：1346；12：新冬17號(hào)；13：新紫2號(hào)；14：銘賢169；15：新紫1號(hào)；16：新冬20號(hào)； 17：新春18號(hào)；18：新冬18號(hào)；19：空白

上圖：用引物Yr10F/Yr10R檢測(cè)結(jié)果；下圖：用引物Yr10F1/Yr10R1檢測(cè)結(jié)果

Yr10F/Yr10R (above) andYr10F1/Yr10R1 (below)

M: 100 bp; 1: Avocet S*6/Yr10; 2: Avocet S; 3: 1229; 4: 1309; 5: Xinchun No.12; 6: Xinchun No.34; 7: Xinchun No.15; 8: 1245; 9: 1354; 10: 366S; 11: 1346; 12: Xindong No.17; 13: Xinzi No.2; 14: Mingxian169; 15: Xinzi No.1; 16: Xindong No.20; 17: Xinchun No.18; 18: Xindong No.18; 19: blank

圖1 部分供試小麥品種的Yr10 檢測(cè)結(jié)果
Fig.1 PCR detection ofYr10 in partial tested wheat cultivars

2.2 1BL/1RS易位的分子標(biāo)記檢測(cè)

根據(jù)Francis等開(kāi)發(fā)的SCAR標(biāo)記AF1/AF4，攜帶1BL/1RS易位的小麥材料理論上能擴(kuò)增出1.5 kb的特征條帶，沒(méi)有該易位系的材料則在1.5 kb處無(wú)條帶[18]。結(jié)果表明，46份供試材料中，新冬24號(hào)、新冬46號(hào)、MJ307、HMJ555、1112、新紫1號(hào)、983S、新麥211、新麥23能擴(kuò)增出1.5 kb的特異性條帶，據(jù)此結(jié)果推測(cè)這9份小麥品種含有1BL/1RS易位，占供試品種(系)的19.57%。表2，圖2

M：DL2000；1：洛夫林10號(hào)；2：Avocet S；3：1245；4：MJ307；5：HMJ555；6：1112；7：新春18號(hào)；8：新春26號(hào)；9：10H4670；10：新冬24號(hào)；11：新冬46號(hào)；12：新冬17號(hào)；13：新紫1號(hào)；14：新冬20號(hào)；15：983S；16：新麥211；17：新麥23；18：0727-1；19：空白

M: DL2000; 1: Lovrin 10; 2: Avocet S; 3: 1245; 4: MJ307; 5: HMJ555; 6: 1112; 7: Xinchun No.18; 8: Xinchun No.26; 9: 10H4670; 10: Xindong No.24; 11: Xindong No.46; 12: Xindong No.17; 13: Xinzi No.1; 14: Xindong No.20; 15: 983S; 16: Xinmai 211; 17: Xinmai 23; 18: 0727-1; 19: blank

圖2 部分供試小麥品種的1BL/1RS檢測(cè)結(jié)果
Fig.2 PCR detection of 1BL/1RS in partial tested wheat cultivars表2 供試小麥品種(系)及其分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果
Table 2 Wheat cultivars tested and their results of molecular detection

編號(hào)No.品種Cultivar檢測(cè)結(jié)果 DetectionresultsYr101BL/1RS編號(hào)No.品種Cultivar檢測(cè)結(jié)果 DetectionresultsYr101BL/1RS1新春6號(hào)——241309——2新春10號(hào)——251229——3新春11號(hào)——26983-S—+4新春12號(hào)——271346——5新春15號(hào)——281357——6新春18號(hào)——29新麥211—+7新春20號(hào)——30新麥23—+8新春26號(hào)——31Y-20——9新春27號(hào)——32新冬46號(hào)—+10新春29號(hào)——33新紫1號(hào)—+11新春33號(hào)——34新紫2號(hào)——12新春34號(hào)——35中優(yōu)9507——131245——36新冬17號(hào)+—141330——37新冬18號(hào)——151360——38新冬20號(hào)—1610H4670——39新冬22號(hào)——170731——40新冬23號(hào)——181242——41新冬24號(hào)—+19HMJ555—+42新冬28號(hào)——201112—+43新冬32號(hào)——21MJ307—+44新冬40號(hào)——220727-1——45366S——231354——461352——

注：“+”：存在；“—”：不存在

Note: “+”: Present; “—”: Absent

3 討 論

高致病力小種的產(chǎn)生和發(fā)展是造成小麥品種抗銹性“喪失”的主要原因，抗病品種的不合理布局和單一化種植削弱了品種的抗病性，低溫及不合理營(yíng)養(yǎng)環(huán)境對(duì)病菌的侵染也有一定促進(jìn)作用[21]。條銹菌生理小種變異造成了小麥原有抗性喪失，致使小麥栽培品種大規(guī)模更替，因而篩選抗病基因和培育抗病品種尤為重要[22-23]。Yr10來(lái)源于普通小麥，定位于1BS，存在于Moro、Crest等品種中，Moro在美國(guó)推廣不久，就出現(xiàn)了能克服其抗性的毒性基因，但現(xiàn)在Yr10幾乎抗國(guó)內(nèi)所有生理小種，仍是有效抗性基因[24-25]。2004年新疆麥區(qū)出現(xiàn)了條中32，到2007年已成為新疆優(yōu)勢(shì)小種，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，2007年新疆小麥條銹病發(fā)生面積達(dá)到1.05×104hm2(15.9萬(wàn)畝)的峰值[3]，研究人員對(duì)條銹菌流行小種條中32毒性譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)，Yr10不受其毒性影響[26]。研究使用兩個(gè)與Yr10緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)新疆麥區(qū)小麥品種(系)進(jìn)行抗性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)46個(gè)品種(系)中，只有新冬17號(hào)能完全檢測(cè)出兩條特征帶，其它品種(系)則兩條特征帶都無(wú)法檢出，說(shuō)明新冬17號(hào)可能含有Yr10基因。伍玲等[10]檢測(cè)了72份四川省小麥區(qū)試材料，含有Yr10的品種(系)僅有1個(gè)，李峰奇等[9]對(duì)黃淮麥區(qū)的126份小麥材料進(jìn)行檢測(cè)，僅4份品種含有Yr10基因，占全部材料的3.17%。綜合研究對(duì)新疆主要小麥品種(系)中Yr10的檢測(cè)結(jié)果，說(shuō)明該抗條銹基因可能還沒(méi)有被普遍應(yīng)用在小麥育種中，結(jié)合新疆小麥條銹病的發(fā)生情況，應(yīng)及時(shí)開(kāi)展針對(duì)Yr10的抗性基因篩選，作出應(yīng)變措施。1BL/1RS易位系源于黑麥，帶有抗條銹基因Yr9、抗葉銹基因Sr31、抗白粉病基因Pm8以及抗桿銹基因Lr26[25]。在20世紀(jì)70～80年代，1BL/1RS易位在抗病育種中曾起著積極的作用[27]，然而隨著所攜帶的抗性基因抗性喪失以及對(duì)面粉面團(tuán)品質(zhì)的不良影響，小麥育種中逐漸減少了1BL/1RS的使用[28-29]。2013年，魏學(xué)軍等[30]采用ω-secalin 和Glu-B3兩個(gè)標(biāo)記檢測(cè)了1BL/1RS在53個(gè)小麥抗源材料中1BL/1RS的分布情況，明確了1BL/1RS易位在中國(guó)的分布及利用情況。曹世勤等[31]對(duì)甘肅省50個(gè)小麥主要品種(系)進(jìn)行基因推導(dǎo)及分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有5和14份材料含有Yr9 (1BL/1RS)，與之前相比利用頻率明顯降低。研究對(duì)近年來(lái)新疆小麥種植區(qū)主栽品種和一些品系對(duì)1BL/1RS易位的使用頻率進(jìn)行檢測(cè)，檢出率為19.57%，其中部分品種(系)的檢測(cè)結(jié)果與王亮等[29]的研究基本一致。考慮到不合理使用1BL/1RS對(duì)小麥病害發(fā)生及控制的影響，在小麥種植和育種時(shí)應(yīng)合理布局品種，謹(jǐn)慎使用含有該易位系的材料。

研究所利用的小麥條銹病抗性基因檢測(cè)標(biāo)記雖然均為比較成熟的分子標(biāo)記，但分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)情況和基因分子檢測(cè)體系對(duì)結(jié)果有較大的影響，因此分子標(biāo)記手段目前只能作為初步診斷抗性基因有無(wú)的工具，單獨(dú)靠檢測(cè)某一基因分子標(biāo)記特征帶的有無(wú)無(wú)法確切得出基因有無(wú)的結(jié)論。將繼續(xù)利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)新疆主要小麥品種(系)進(jìn)行抗條銹病基因檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合系譜分析，使用基因推導(dǎo)等方法使檢測(cè)結(jié)果日益準(zhǔn)確完善。

4 結(jié) 論

對(duì)當(dāng)前小麥條銹病流行小種條中32號(hào)具有較好抗性的Yr10基因在新疆麥區(qū)小麥品種中分布率很低，可能含有Yr10基因的新冬17號(hào)對(duì)降低該區(qū)小麥條銹病的發(fā)生傳播具有較高價(jià)值，小麥新品種選育，特別是針對(duì)小麥條銹病常發(fā)易發(fā)麥區(qū)的品種選育中應(yīng)加強(qiáng)Yr10抗性基因的利用。1BL/1RS在新疆麥區(qū)小麥品種中雖然檢出率低，但在選育新品種時(shí)仍需注意減少1BL/1RS易位的分布頻率。

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Supported by: Autonomous Region Science and Technology Program"Research and application of monitoring and sustainable control of wheat rust and powdery mildew in Xinjiang" (2013911092), Xinjiang Comprehensive Experimental Station of National Wheat Industry Technology System (CARS-3-65), Special Fund for Innovation and Development of Scientific Research Institutions (2016D04009), Autonomous Region Key R&D Program "Research and demonstration on wheat cultivation technology by drip irrigation which integrated fertilizer and pesticide"(2016B01002-3)

LI Guang-kuo(1973-), male, associate research fellow, research direction: pest control of grain crops Liu En-liang(1984-), male, Research assistant, Research direction: Wheat and sweet potato cultivation breeding research work

Molecular Detection of Stripe Rust-Resistant Genes in Main Wheat Varieties (Lines) from Xinjiang

BAI Wei-wei1, GAO Hai-feng1, ZHANG Hang1, LEI Jun-jie2, GAO Yong-hong2, LI Guang-kuo1

(1.ResearchInstituteofPlantProtection/KeyLaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCropVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.China,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.InstituteofGrainCrop,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 The major purpose of the study is to make sure the distribution of stripe rust-resistant genesYr10 and 1BL/1RS translocation in wheat cultivars or breeding lines in Xinjiang. 【Method】Forty six wheat cultivars and breeding lines collected from Xinjiang wheat areas were tested by using molecular markers of stripe rust-resistant genesYr10 and 1BL/1RS translocation. 【Result】Yr10 was only detected in Xindong No.17 and 1BL/1RS was detected in Xindong No.24, Xindong No.46, MJ307, HMJ555, 1112, Xinzi No.1, 983-S, Xinmai 211 and Xinmai 23, which accounted for 19.57% among the total testing materials. 【Conclusion】The distribution ofYr10 which demonstrates good resistance to CYR32 is low in Xinjiang wheat region cultivars, and Xindong No.17 which may containYr10 has certain value in breeding disease resistance materials, which shows that the distribution frequency of 1BL/1RS translocation should be reduced when breeding new varieties.

wheat; stripe rust; molecular marker; resistance genes

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.03.014

2016-12-04

自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目“新疆小麥銹病和白粉病監(jiān)測(cè)及可持續(xù)防控技術(shù)研究與應(yīng)用”(2013911092)；國(guó)家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系新疆綜合試驗(yàn)站(CARS-3-65)；自治區(qū)科研機(jī)構(gòu)創(chuàng)新發(fā)展專項(xiàng)資金(2016D04009)；自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“滴灌小麥水肥藥一體化栽培技術(shù)研究與示范”(2016B01002-3)

白微微(1988-)，女，助理研究員，研究方向?yàn)榧Z食作物病蟲害防治，(E-mail)hebaige@163.com

李廣闊(1973-)，男，河南人，副研究員，研究方向?yàn)榧Z食作物病蟲草害防治，(E-mail)lgk990808@163.com 劉恩良(1984-)，男，甘肅人，助理研究員，研究方向?yàn)樾←溂案适碓耘嘤N，(E-mail): liuenliang_513@163.com

S435.121.4；S188

A

1001-4330(2017)03-0497-08