甲硝唑殘留的膠體金試紙條的研制

呼秀智，陳笑笑，胡葉軍*，繆翁晟途，薛占永，孫曉崢

(1.河北工程大學，河北邯鄲 056021；2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江杭州 310051)

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甲硝唑殘留的膠體金試紙條的研制

呼秀智1，陳笑笑2，胡葉軍2*，繆翁晟途2，薛占永1，孫曉崢1

(1.河北工程大學，河北邯鄲 056021；2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江杭州 310051)

為方便藥物殘留的現(xiàn)場快速檢測，利用膠體金免疫層析技術研制出了一種快速檢測蜂蜜樣本中甲硝唑殘留的試紙條。將人工抗原與二抗包被到硝酸纖維素膜上依次作為檢測線和控制線，樣本中的甲硝唑與檢測線上的人工抗原競爭性結合膠體金結合墊上的抗體-膠體金結合物，根據(jù)檢測線和控制線的顯色情況判斷樣本的陰陽性。結果顯示：試紙條上人工抗原MNZ-BSA的包被量為0.5 mg/mL，二抗羊抗鼠IgG的包被量為0.54 mg/mL；試紙條對于甲硝唑的檢出限為1 μg/kg，與4種硝基咪唑類藥物有交叉反應，但甲硝唑的檢出限最低；樣本中添加溶液A處理并用乙酸乙酯作為提取劑，單個樣本檢測時間為20 min。該方法適用于甲硝唑殘留的大規(guī)模現(xiàn)場快速檢測。

膠體金；甲硝唑；試紙條；快速檢測

甲硝唑(Metronidazole，MNZ)又名滅滴靈，化學名稱為2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇，屬于硝基咪唑類藥物。20世紀60年代，甲硝唑的抗厭氧菌感染的作用被研究人員發(fā)現(xiàn)[1]，并于1978年被世界衛(wèi)生組織定為抗厭氧菌首選藥[2]。甲硝唑分子量171，為小分子物質，能以擴散的方式直接進入細菌細胞內(nèi)。在無氧或者少氧的環(huán)境中，硝基能被電子傳遞蛋白還原成具有高細胞毒性的氨基。與細菌DNA反應時，能阻斷其轉錄與復制，破壞其雙螺旋結構，降解已合成的DNA，導致細胞死亡，最終起到快速殺滅厭氧細菌和抑制感染的作用[3-5]。因此，甲硝唑是治療滴蟲病和阿米巴病的特效藥[1]，常被用于畜牧生產(chǎn)中。甲硝唑大量的不合理使用已造成動物源性食品中該類藥物的殘留。臨床研究表明，甲硝唑攝入過量會引起消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿道的毒副反應，導致皮膚過敏及過敏性休克[6-7]。動物試驗結果表明，甲硝唑有潛在的致癌性[8]。因此，各國對于該藥物的用量都有嚴格限制。1998年，歐盟已禁止甲硝唑用于食用動物；2002年，美國FDA禁止甲硝唑在動物源性食品中使用[5]；我國農(nóng)業(yè)部第235號公告中規(guī)定甲硝唑允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出[9]。2002年，我國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)了《無公害食品蜜蜂飼養(yǎng)獸藥使用準則》，其中明確規(guī)定甲硝唑在蜂蜜中為不得檢出[10]。但因抗菌效果顯著且價格低廉，許多蜂農(nóng)依舊使用甲硝唑防治蜜蜂的孢子蟲病，從而導致蜂蜜中甲硝唑殘留的產(chǎn)生。目前，檢測甲硝唑殘留的方法主要有高效液相色譜法[11-13]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[14-17]、加壓毛細管電色譜法[18]、碳糊電極法[19]、酶聯(lián)免疫分析法[20]等。雖然以上方法靈敏度高、重復性好、檢出限低，但是樣品前處理麻煩、對儀器設備要求高，對操作人員也有較高要求，不適用于現(xiàn)場快速檢測。本研究基于膠體金免疫層析技術，開發(fā)了一種靈敏度高、特異性好、可實現(xiàn)快速現(xiàn)場檢測的甲硝唑膠體金試紙條。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 氯金酸、聚乙二醇20000(PEG-20000)、海藻糖、羊抗鼠IgG、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、Tween-20,美國Sigma-Aldrich公司；檸檬酸三鈉、NaH2PO4、KH2PO4、Na2HPO4、甲醇、NaN3、HCl、乙腈、NaOH、甲硝唑、替硝唑、奧硝唑、二甲硝唑、羅硝唑標準品,華東醫(yī)藥股份有限公司；硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維購于美國Millipore公司。

1.1.2 儀器設備 UV-2802紫外連續(xù)掃描分光光度計,美國UNICO公司；MYP11-2恒溫磁力攪拌器,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；BioJet XYZ3000型點膜機,美國BioDot；恒溫鼓風干燥箱,上海精宏實業(yè)設備有限公司；切割機,杭州市恒通設備有限公司；膠體金讀數(shù)儀為杭州南開日新生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 溶液配置 PBS緩沖液：準確稱取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶于800 mL蒸餾水中，攪拌使各組分充分溶解，用HCl調節(jié)溶液pH值至7.4后，加蒸餾水定容至1 L，得到0.01 mol/L的PBS緩沖液。

PBST緩沖液：0.01 mol/L的PBS溶液中加入0.05% Tween-20。

PB溶液：準確稱取NaH2PO4·H2O 2.6 g加蒸餾水溶解稀釋至1 L，得到0.2 mol/L NaH2PO4水溶液。準確稱取Na2HPO4·7H2O 53.6 g，加蒸餾水溶解稀釋至1 L，得到0.2 mol/L Na2HPO4水溶液。取19 mL 0.2 mol/L NaH2PO4水溶液加入到81 mL 0.2 mol/L Na2HPO4水溶液中，得到0.2 mol/L PB溶液，加蒸餾水至2 L則成0.01 mol/L PB溶液。

PB緩沖液：0.01 mol/L PB溶液中加入0.2% NaN3。

標準溶液配置：用蒸餾水溶解標準品至濃度為100 mg/L的標準溶液，后續(xù)試驗中，可用蒸餾水稀釋成實際所需的濃度。

1.2.2 甲硝唑人工半抗原合成 參照佟宇川的方法[20]，合成甲硝唑半抗原，4-(2-(2-甲基-5-硝基咪唑)-4-氧代)丁酸MSA。

1.2.3 甲硝唑人工抗原合成 參照陳昱潤的方法[21]，合成甲硝唑人工抗原MSA-BSA、MSA-OVA。

1.2.4 甲硝唑單克隆抗體的制備 參照石金磊、范國英等的方法[22-23]，調整試驗中的參數(shù)，制備純化甲硝唑單克隆抗體。

1.2.5 膠體金溶液制備 準確稱取一定量氯金酸，加超純水得到0.01%的氯金酸水溶液，取100 mL加熱至煮沸，邊攪拌邊加入1.50 mL 1%檸檬酸三鈉溶液。繼續(xù)加熱煮沸至溶液呈酒紅色，冷卻至室溫，加超純水恢復至原體積，4 ℃儲存。

1.2.6 抗體-膠體金結合物

1.2.6.1 標記pH值的確定 取9個1.5 mL離心管依次編號，每管加入1 mL膠體金溶液，用K2CO3和HCl調各管溶液的pH依次為3、4、5、6、7、8、9、10、11，搖晃混勻。分別在每管中加入一定量甲硝唑單抗，混勻后靜置10 min，后加入100 μL 10% NaCl溶液，室溫反應10 min，觀察溶液顏色變化。將溶液顏色為紅色的管子離心取上清，測定OD520的值，該值最大處的pH為標記pH。

1.2.6.2 膠體金標記抗體的最佳標記量測定 取7個1.5 mL離心管依次編號，每管加入1 mL膠體金溶液，用K2CO3調至標記pH，每管分別加入0、5、10、20、30、40、50 μg甲硝唑單抗，混勻后室溫靜置10 min。加入100 μL 10% NaCl溶液，室溫靜置10 min。觀察每管溶液顏色變化。若顏色明顯變藍，且出現(xiàn)沉淀，說明抗體量太少，導致膠體金出現(xiàn)沉降；若溶液顏色為發(fā)現(xiàn)明顯變化，仍為紅色，則說明抗體量適合，最先不變色的管子抗體的量為最佳標記量。

1.2.6.3 抗體-膠體金結合物的制備 取已制備好的膠體金溶液50 mL，調至標記pH值，邊攪拌邊加入最適濃度的單克隆抗體，繼續(xù)攪拌20 min，后加入5%的BSA，稀釋至1%BSA。4 ℃，1500 r/min離心10 min后棄上清，沉淀用0.01 mol/LPB緩沖溶液重懸，置于4 ℃保存。

1.2.7 膠體金試紙條的制備

1.2.7.1 檢測線、控制線包被濃度的調試 用緩沖液將MNZ-BSA稀釋至0.1、0.15、0.5、1、1.5、2 mg/mL，二抗(羊抗鼠IgG)稀釋至0.1、0.5、1、1.5、2 mg/mL，依次包被到NC膜上，與抗體-膠體金結合墊等組裝成試紙條后，用PBST溶液滴板，觀察兩條線的顯色情況，同時用金標讀數(shù)儀讀取檢測線(T線)、控制線(C線)的值及兩者的比值(T/C)，以T/C值為1～2且顯色良好時的濃度為工作濃度。

1.2.7.2 膠體金試紙條的組裝 將稀釋好的MNZ-BSA和羊抗鼠IgG通過點膜機噴于NC膜上，形成間隔5 mm的檢測線(T線)和控制線(C線)，37 ℃烘箱干燥7 h；抗體-膠體金結合物溶液按3 μL/cm噴至玻璃纖維上作為膠體金結合墊，37 ℃烘箱干燥8 h；依次將樣品墊、膠體金結合墊、NC膜、吸水墊粘于PVC板上，用切條機切成3.84 mm寬度的試紙條，裝入塑料板殼中壓成試劑板。膠體金試紙條的結構如圖1所示。

圖1 膠體金試紙條結構圖

1.2.8 樣本處理 樣本量的優(yōu)化：分別取1、2、4、5 g 蜂蜜樣本各2組，一組作為空白樣品，一組添加1 μg/L的甲硝唑標準品溶液，對樣本進行處理后觀察空白組及添標組的顯色情況。

樣本添加溶液優(yōu)化：分別將溶液A、溶液B、蒸餾水、PBS、飽和NaCl、HCl、乙醇、甲醇、NaOH作為添加溶液對空白樣本及添標樣本(1μg/kg)進行處理，觀察顯色情況。

提取劑優(yōu)化：分別以乙酸乙酯、添加乙腈的乙酸乙酯及異丙醇作為提取劑提取空白樣本及添標樣本(1 μg/kg)，觀察顯色情況。

樣本處理過程：取蜂蜜4 g于15 mL離心管中，加入1 mL 溶液A，充分振蕩至完全溶解后加入8 mL乙酸乙酯上下翻轉振蕩3 min，靜置后取上清4 mL于5 mL離心管中吹干，加300 μL復溶液，用滴管沖洗，充分溶解管內(nèi)壁殘留，取100 μL待檢。

1.2.9 樣本檢測 測試前，須將試劑板和待檢樣本溶液恢復至室溫(20～30 ℃)。

操作步驟：將組裝好的試劑板水平放置于觀察者正面，用滴管吸取待檢樣本溶液于加樣孔中垂直滴加3滴(約100 μL)，加樣后開始計時，在3～5 min內(nèi)判讀結果，其他時間判讀無效。

結果判讀：本試驗采用對比法判讀試驗結果。若T線(檢測線，靠近加樣孔一端)顯色比C線(控制線)顯色深或一樣深，判定為陰性；若T線顯色比C線顯色淺，或T線無顯色，判定結果為陽性；若C線未出現(xiàn)則判定為無效。

1.2.10 試紙條各項指標測定

1.2.10.1 試紙條檢出限 取蜂蜜空白樣本進行預處理，添標至甲硝唑終質量分數(shù)為0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、20 μg/kg，按優(yōu)化后的方法處理樣本并檢測，每個濃度設3個重復，滴板檢測并記錄檢測結果。

1.2.10.2 試紙條假陽性率 取蜂蜜空白樣本20份進行預處理，按優(yōu)化后的方法處理樣本并檢測，滴板檢測并記錄檢測結果。統(tǒng)計陽性結果，計算假陽性率。

1.2.10.3 試紙條假陰性率 取蜂蜜空白樣本進行預處理，添標至甲硝唑終質量分數(shù)為1、2.5、5、10、20 μg/kg，按優(yōu)化后的方法處理樣本并檢測，每個濃度設10個重復，滴板檢測并記錄檢測結果，計算假陰性率。1.2.10.4 試紙條均一性 用切條機將組裝好的大卡切成3.84 mm的試紙條后，取來自于兩張大卡的位于NC膜前后兩端及中間的試紙條各2條組裝成試劑板，用復溶液進行滴板，測試試紙條的均一性。

1.2.10.5 試紙條特異性 取甲硝唑、替硝唑、奧硝唑、二甲硝唑、羅硝唑標準品，配不同梯度的標準品溶液進行復溶液、樣本測試，重復3次，統(tǒng)計結果。

1.2.10.6 試紙條穩(wěn)定性 將組裝好的試紙條置于放入干燥劑的鋁箔袋中密封，室溫干燥條件下保存，于生產(chǎn)當天，后每隔1個月抽取適量試紙條對空白樣本、對終質量分數(shù)為1 μg/kg的甲硝唑添標樣本進行檢測，重復5次，根據(jù)結果判定試紙條的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 檢測線、控制線包被濃度 本試紙條以對比法判斷試驗結果，同時用膠體金金標讀數(shù)儀讀取T、C、T/C的值，根據(jù)結果可知，檢測線上MNZ-BSA抗原包被濃度為0.5 mg/mL，控制線上羊抗鼠IgG包被濃度為0.54 mg/mL，此時PBST溶液滴板后顯色梯度最佳。

2.2 標記pH值的確定 根據(jù)之前所述試驗方法，確定標記pH值為7.4。

2.3 膠體金標記抗體的最佳標記量的確定 根據(jù)之前所述試驗方法，膠體金標記抗體最佳標記量為25 μg/mL，此時試劑條顯色最佳。

2.4 樣本處理優(yōu)化結果 相較于其他的樣本量，4 g的樣本處理方法結果顯示陰陽性之間顯色差異不明顯。樣本中加入飽和NaCl后，顯色梯度不大，而加入HCl和乙醇后顯色幾乎沒有梯度，加入蒸餾水后顯色梯度一般，加入溶液A、溶液B、PBS緩沖液后，顯色梯度好，測試不同濃度的溶液A、溶液B、PBS緩沖液顯色梯度后，確定溶液A為樣本的添加溶液。對比提取劑乙酸乙酯中含乙腈和不含乙腈的結果，表明用含乙腈的乙酸乙酯會導致結果偏陽性；以異丙醇為提取劑時，陰性和陽性結果顯色并未明顯加強，因此本試驗中以乙酸乙酯作為提取劑。

2.5 試紙條檢出限 根據(jù)表1可知，該試紙條檢出限為1 μg/kg，其中甲硝唑質量分數(shù)為10 μg/kg時T線消失。

表1 試紙條檢出限

2.6 試紙條假陽性率 試紙條的假陽性率試驗結果如表2所示， 20份陰性空白樣本的假陽性率為5%，說明試紙條具有較好的陽性分辨率。

表2 試紙條假陽性率

2.7 試紙條假陰性率 試紙條的假陽性率試驗結果如表3所示，50份加標樣本的假陰性率為4%，說明試紙條在甲硝唑1 ～20 μg/kg濃度范圍內(nèi)有穩(wěn)定的檢測能力。

表3 試紙條假陰性率

2.8 試紙條均一性 試紙條的均一性試驗結果如表4所示，表中數(shù)據(jù)為T/C的值。對比兩張卡的相同位置顯色和梯度可知試驗結果無明顯差異，說明卡間均一性良好。對比同一卡內(nèi)不同位置顯色和梯度，發(fā)現(xiàn)卡中間比兩頭顯色稍淺，但差異不大，因此認為卡內(nèi)的均一性也良好。

表4 試紙條均一性

2.9 試紙條特異性 試紙條特異性測試結果如表5、表6所示。由表5可知，試紙條對復溶液中甲硝唑的檢出限為1 μg/L；由表6可知，試紙條對樣本中甲硝唑的檢出限為1 μg/kg；其他4種硝基咪唑類藥物的檢出限相對較高。由表5、表6對比得，試紙條對復溶液中甲硝唑的檢出限與樣本中甲硝唑的檢出限相同，排除了樣本基質效應對結果的影響，表現(xiàn)出試紙條對檢測甲硝唑的強特異性。其他4種硝基咪唑類藥物因樣本基質作用影響，標準品添加在復溶液中的檢出限比添加在樣本中的要低。由此可知，從檢測限濃度與基質效應兩方面比較得出本試紙條可以用于檢測甲硝唑殘留的特異性更強，同時也可用于初步檢測其他4中硝基咪唑類藥物的殘留。

表5 復溶液中添加標準品試紙條特異性測試結果

表6 樣本添加標準品試紙條特異性測試結果

2.10 試紙條穩(wěn)定性 試劑條穩(wěn)定性試驗結果如表7所示。在室溫條件下保存，12個月內(nèi)試紙條的顯色梯度均未發(fā)生明顯變化，假陽性率與假陰性率較低，檢出限為1 μg/kg。從第13個月起試紙條顯色出現(xiàn)偏差，假陽性率與假陰性率均逐漸增大。因此，甲硝唑膠體金試紙條在室溫條件下可保存12個月。

表7 試紙條穩(wěn)定性試驗結果

3 討論與小結

研究基于膠體金免疫層析原理，通過制備甲硝唑單克隆抗體成功研制了甲硝唑膠體金試紙條。樣本前處理簡單，通過提取、吹干、復溶即可進行滴板測試，整個過程只要20 min。相較于HPLC、ELISA等方法，遠遠縮短了檢測時間。通過優(yōu)化樣本處理過程，改善了顯色梯度，同時也提高了試紙條的檢出限。結果表明，本試紙條檢出限為1 μg/kg，在同行業(yè)中處于較優(yōu)水平。與其他4種硝基咪唑類藥物替硝唑、奧硝唑、二甲硝唑、羅硝唑的特異性試驗結果顯示，甲硝唑的檢出限最低，其他4種硝基咪唑類藥物的檢出限相對較高。因此，本試紙條亦可用于替硝唑、奧硝唑、二甲硝唑、羅硝唑殘留的初步檢測。穩(wěn)定性試驗表明，在室溫條件下，本試紙條的保存時間長達1年，穩(wěn)定性高。

本試紙條操作簡單、檢測時間短、靈敏度高、保存時間長、成本低，適用于工商管理部門、食品加工企業(yè)等對甲硝唑在蜂蜜中殘留的快速檢測，同時也能初步檢測替硝唑、奧硝唑、二甲硝唑、羅硝唑在蜂蜜中的殘留，為大批量樣本初篩提供依據(jù)。

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(編輯：陳希)

Development of a Colloidal Gold Strip for Metronidazole Residues

HU Xiu-zhi1，CHEN Xiao-xiao2，HU Ye-jun2*， MIUWEN Sheng-tu2,XUE Zan-yong1，SUN Xiao-zheng1

(1.HebeiUniversityofEngineering，Handan056021，China；2.HangzhouNankaiBiotechCo.Ltd.，Hangzhou310051，China)

In order to achieve a rapid detection in drug residues field. A rapid method for detecting metronidazole residues in honey samples was developed by using colloidal gold immune chromatography technology. The MNZ-BSA and secondary antibody were covered into nitrocellulose membrane as test lines, which could compete the binding between metronidazole monoclonal antibody coating colloidal gold and free metronidazole, and results could be clarified by colors of two test lines. The results showed that the working concentration of MNZ-BSA was 0.5 mg/mL, and goat anti mouse IgG was 0.54 mg/mL. The detection limit of the strip for MNZ was 1 μg/kg. There were four kinds of nitro imidazoles drugs crossing reaction. The sample was added into solution A and extracted by ethyl acetate, and the result could be obtained in 20 min. This strip was available for rapid detection of metronidazole residues.

colloidal gold；metronidazole；strip；rapid detection

主要抗生素殘留快速檢測關鍵技術研究(1522101042)

呼秀智，碩士，副教授，從事食品安全檢測方面研究。

胡葉軍。E-mail:hyj664@163.com

2016-09-21

A

1002-1280 (2017) 03-0032-07

S859.79