肉桂醛體外抑制奶牛乳房炎主要致病菌的研究

程浩，周夢潔，胡飛，葉蔥蔥，彭本英，張佳蘭

(長江大學動物科學學院，湖北荊州，434025)

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肉桂醛體外抑制奶牛乳房炎主要致病菌的研究

程浩，周夢潔，胡飛，葉蔥蔥，彭本英，張佳蘭*

(長江大學動物科學學院，湖北荊州，434025)

研究天然化合物肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌——大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌效果。采用試管二倍稀釋法測得肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌和標準金黃色葡萄球菌的體外最小抑菌濃度(MIC)分別為3.2 mmol/L和1.6 mmol/L；鏈球菌1.6 mmol/L；大腸桿菌和標準大腸桿菌6.4 mmol/L和3.2 mmol/L，且能完全抑制這三種菌的生長。肉桂醛的最小殺菌濃度(MBC)金黃色葡萄球菌和標準金黃色葡萄球菌分別為25.6 mmol/L和12.8 mmol/L；鏈球菌12.8 mmol/L；大腸桿菌和標準大腸桿菌25.6 mmol/L和12.8 mmol/L；在7 h內能有效殺滅這三種菌，肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌有抑菌和殺菌能力，是一種潛在的奶牛乳房炎的臨床治療藥物。

肉桂醛；乳房炎；抑菌；殺滅

目前奶牛生產中主要采用抗生素藥物防治奶牛乳房炎，容易導致牛奶中抗生素殘留及細菌產生耐藥性，發展高效、無毒、無殘留、安全的獸藥成為防治奶牛乳房炎的研究熱點。肉桂醛是肉桂科植物提取物的主要生物有效物質，為單一有機化合物。肉桂醛液體無色或淡黃色，有強烈的香氣，難與水混勻，易與醇、醚混勻，易揮發，易氧化，對酸、堿不穩定。肉桂醛能較好抑制各種菌生長，并能殺滅各種細菌，同時也是抗真菌的活性物質[1-2]。有研究發現肉桂醛能特異性破壞細菌細胞壁葡聚糖和幾丁質的合成，從而損傷細胞壁，進入細胞內，進而損傷細胞內的微結構而消滅細菌[3]。肉桂醛對大腸桿菌產生氧化脅迫，使過量的活性氧積累在大腸桿菌細胞內，升高SOD 活力，進一步氧化損傷細胞膜脂質，從而損傷和破壞細胞結構，最終導致大腸桿菌死亡[4]。因為肉桂醛能有效抑制細菌繁殖、防止微生物生長，且毒副作用低[5-6]，其在醫藥、化工、食品和飼料等行業被廣泛應用。肉桂醛作為飼料添加劑具有促進畜禽生長發育、促進飼料在動物體內的利用效率(增加營養素在畜禽體內的沉積量)、預防動物感染性疾病、抑制飼料中霉菌繁殖等作用。在養牛業中，肉桂醛作為瘤胃改良劑添加于飼料中能提高養牛效益[7-8]。本研究結合肉桂醛的抑菌、低毒及應用于牛飼料添加劑的特點，研究天然化合物肉桂醛對奶牛乳房炎主要病原菌的體外抑菌作用，以期為肉桂醛防治奶牛乳房炎提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株及試劑 試驗所用的金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)和無乳鏈球菌(S.agalactiae)均為本實驗從鮮乳樣中分離純化并鑒定得到。同時購買標準菌種大腸桿菌(ATCC 43890)和金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)做對照。營養肉湯培養基和營養瓊脂由環凱微生物科技(生產批號分別為201510243、201508102)提供。無水乙醇為分析純，98%的肉桂醛溶液由江西雪松天然藥用油有限公司(生產批號150612)提供。

1.2 菌液與藥液的配制 從液氮中取出40%甘油保護的各個菌株貯備菌液100 μL混勻于各自相應的培養基，于37 ℃，200 r/min的恒溫搖床擴繁至快速生長階段。然后在各自對應的固體、液體培養基中連續劃線接種、擴繁兩次來保證菌株旺盛的生命力(使用固體培養基37 ℃，0.5～1 d)。

無菌條件下分別挑取各個菌株的單菌落并在菌株對應的液體培養基中于37 ℃，200 r/min的恒溫搖床擴繁至快速生長階段(722E分光光度計測定OD600 nm=0.3，上海光譜儀器有限公司)[9]，后用倍比稀釋法在顯微鏡下計數，用各個菌株對應的液體培養基稀釋菌液為1×108CFU/mL，冷藏用作試驗。98%肉桂醛用75%酒精1∶9稀釋，使肉桂醛濃度為741.5 mmol/L，-20 ℃保存備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用

1.3.1.1 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的最小抑菌濃度(MIC) 采用各個菌株對應的液體培養基稀釋法測定肉桂醛抑制奶牛乳房炎主要致病菌的最小濃度。將每13個滅菌試管排一列，每一列試管按表1加各個菌株對應的液體培養基、肉桂醛及稀釋菌液[9-10]，使細菌為5×105CFU/mL，恒溫(37 ℃)培養0.5～1 d。光下肉眼觀察試管中液體，以試管中液體透明、不分層和培養前一樣的最小肉桂醛濃度作為其MIC，且重復三次MIC相同。

1.3.1.2 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌生長曲線的影響 無菌條件下從各個菌株固體培養基分別挑單菌落置于裝有 3 mL 各自適宜液體培養基的試管內,并置于生化培養箱(LRH-250A，廣東省醫療器械廠)中(37 ℃，12 h)靜置培養。然后無菌條件下將 3 mL 的過夜培養的液體培養基菌液轉接至 97 mL相應的液體培養基中,并置于全溫震蕩器中37 ℃、200 r/min 培養至快速生長階段(OD600 nm=0.3，722E分光光度計，上海光譜儀器有限公司)。將上述將制備的菌液分別分裝于6個 50 mL 的三角錐形瓶中，每個錐形瓶 15 mL，其中 5 個三角錐形瓶中肉桂醛終濃度分別為1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC；一個乙醇濃度為0.05%。將這6個 50 mL 三角錐形瓶置于全溫震蕩器中 37 ℃、200 r/min 培養，分別于 0、1、2、3、4、6、8、10 、12 h 測量一次OD600 nm(722E分光光度計，上海光譜儀器有限公司)值，然后繪制 OD值-時間曲線。

表1 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的最小抑菌濃度

1.3.2 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的殺滅作用

1.3.2.1 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的最小殺滅濃度 類似于前面的處理，每7個滅菌試管排一列，試管的處理見表2，恒溫(37 ℃)培養0.5～1 d后，光下肉眼觀察試管中液體。把肉眼觀察全部透明、不分層試管的液體通過接種環取液劃線各個菌株對應的固體培養平板上，恒溫(37 ℃)培養2 d。查看細菌生長情況，以菌落數不大于5個時的肉桂醛濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

表2 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的最小殺滅濃度

1.3.2.2 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌殺菌曲線的影響 菌種準備、擴大培養、分裝及培養同上面。其中5個三角錐形瓶中肉桂醛終濃度分別為1/8 MBC、1/4 MBC、1/2 MBC、MBC和2 MBC；一個乙醇濃度為0.05%。在0、1、3、5、7、9、12、18 h 取樣并稀釋，用平板法計其活菌數，繪出細菌數-時間曲線。

2 結果與分析

2.1 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌活性均有抑制，其中金黃色葡萄球菌和標準金黃色葡萄球菌的MIC為3.2 mmol/L和1.6 mmol/L；鏈球菌的MIC為1.6 mmol/L；大腸桿菌和標準大腸桿菌的MIC分別為6.4 mmol/L和3.2 mmol/L。稀釋劑對照組加入最大劑量的稀釋劑，試驗結果表明，稀釋劑不影響奶牛乳房炎主要致病菌的生長。

肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌生長曲線的影響見圖1、圖2和圖3。如圖所示，1/16 MIC、1/8 MIC濃度的肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的生長幾乎沒有影響；1/4 MIC、1/2 MIC濃度的肉桂醛使奶牛乳房炎主要致病菌的生長曲線滯后，而MIC濃度的肉桂醛能有效抑制大腸桿菌和鏈球菌的生長，對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。

圖1 肉桂醛濃度對大腸桿菌生長曲線的影響

圖2 肉桂醛濃度對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響

圖3 肉桂醛濃度對無乳鏈球菌生長曲線的影響

2.2 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的殺滅作用 肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌均有殺滅作用，其中金黃色葡萄球菌和標準金黃色葡萄球菌的MBC分別為25.6 mmol/L和12.8 mmol/L；鏈球菌的MBC為12.8 mmol/L；大腸桿菌和標準大腸桿菌的MBC為25.6 mmol/L和12.8 mmol/L。

對照組添加0.05%的乙醇，7 h時，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的細菌數約是原來的10倍，因此，稀釋劑乙醇對細菌沒有殺滅作用。肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌的殺滅效果和趨勢相似(圖4、圖5和圖6)。1/8 MBC濃度的肉桂醛僅能抑制奶牛乳房炎主要致病菌的生長；1/4 MBC濃度的肉桂醛殺菌作用較弱； 1/2 MBC濃度的肉桂醛18 h內不能完全殺滅細菌；當肉桂醛的濃度為1 MBC和2 MBC時，7 h內能殺滅這3種奶牛乳房炎主要致病菌，且2 MBC的殺菌效果強于1 MBC，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅效果優于無乳鏈球菌。

圖4 肉桂醛對大腸桿菌的殺菌曲線

圖5 肉桂醛對金黃色葡萄球菌的殺菌曲線

圖6 肉桂醛對無乳鏈球菌的殺菌曲線

3 討論與小結

肉桂醛具有揮發性，易氧化，將肉桂醛與其他物質結合，保存容易并能增強其抑菌效果，本研究用75%的乙醇作稀釋劑，效果優于無水乙醇和二甲基亞砜(DMSO)。王新偉等研究結果表明：在植物提取物肉桂油、牛至油、檸檬醛和香芹酚中，肉桂醛的抑菌效果最好，尤其是對金黃色葡萄菌的抑菌效果顯著優于大腸桿菌[11]。本研究的結果與其一致，并且肉桂醛對鏈球菌的抑菌作用最強。關于肉桂醛抑菌的作用機制，一種說法認為肉桂醛能破壞細菌或真菌的結構和功能的完整性，從而殺滅細菌[11-15]。另一種說法認為，肉桂醛通過進入細胞內干擾胞內代謝以及影響基因的正常表達，發揮其抑菌作用[16-19]。

張赟彬等研究表明肉桂醛對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC和MBC，分別為0.25 μl/mL和0.55 μl/mL[20]，而肉桂油對這兩種菌的MIC為1.0 mg/mL，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MBC分別為4.0 mg /mL和2.0 mg/mL[21]，本研究中肉桂醛對大腸桿菌的MIC和MBC分別為6.4 mmol/L和25.6 mmol/L，對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為3.2 mmol/L和25.6 mmol/L。出現這種差異，一方面與肉桂醛的純度有關，也可能與所分離的細菌的耐藥性有關。依據細菌產生耐藥性的標準(MBC≥32 MIC)[9]，說明奶牛乳房炎主要致病菌對肉桂醛尚未產生耐藥性。

本試驗結果表明肉桂醛對奶牛乳房炎主要致病菌有較強的抑菌和殺菌作用，且無耐藥性，說明肉桂醛是一種潛在的奶牛乳房炎的臨床治療藥物。肉桂醛是否具有較好的臨床治療效果還有待進一步的研究。

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(編輯：侯向輝)

Study on Cinnamaldehyde to Inhibit the Main Pathogenic Bacteria of Mastitis in Dairy Cowinvitro

CHENG Hao, ZHOU Meng-jie, HU Fei, YE Cong-cong, PENG Ben-ying, ZHANG Jia-lan*

(CollegeofAnimalScience，YangtzeUniversity，Jingzhou,Hubei434025，China)

The bacteriostatic effect of natural compounds cinnamaldehyde on the main pathogenic bacteriaEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandStreptococcusof dairy cow mastitis was studied. Tube double dilution method was used to measure the minimum inhibitory concentration (MIC) of cinnamaldehyde on main pathogenic bacteria of dairy cow mastitisinvitro. The MIC of cinnamaldehyde againstStaphylococcusaureuswas 3.2 mmol/L and standardsStaphylococcusaureuswas 1.6 mmol/L. The MIC of cinnamaldehyde againstStreptococcuswas 1.6mmol/L,E.coliwas 6.4 mmol/L and standardsE.coliwas 3.2 mmol/L. Cinnamaldehyde can completely inhibit the growth of the three kinds of bacteria. The minimum bactericidal concentration (MBC) of cinnamaldehyde againstStaphylococcusaureusandE.coliwas 25.6 mmol/L. The MBC of cinnamaldehyde against standardsStaphylococcusaureus,Streptococcusand standardsE.coliwas 12.8 mmol/L. These three kinds of bacteria were killed in 7 h by cinnamaldehyde. Therefore, cinnamaldehyde has antibacterial and bactericidal capability against main pathogenic bacteria of dairy cow mastitis. And it is a kind of potential clinical treatment drug of dairy cow mastitis.

cinnamaldehyde; mastitis; antibacterial; sterilization

長江大學第七批大學生創新訓練計劃項目(2014017)

程浩，助理畜牧師，從事生物制品研究。

張佳蘭。E-mail：zjlgpy88@163.com

2016-10-23

A

1002-1280 (2017) 03-0039-05

S859.79