GC法測定市售動物源性中藥材地龍、水蛭中3種氯霉素類藥物的殘留量

王鵬思，李嘉欣，石上梅，薛 健*

(1. 中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京100193；2. 國家藥典委員會，北京 100061)

?

GC法測定市售動物源性中藥材地龍、水蛭中3種氯霉素類藥物的殘留量

王鵬思1，李嘉欣1，石上梅2*，薛 健1*

(1. 中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京100193；2. 國家藥典委員會，北京 100061)

為了建立柱前衍生-GC-ECD法同時測定市售動物源性中藥材地龍、水蛭中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素3種氯霉素類抗生素殘留量的方法，樣品經乙酸乙酯超聲提取，旋轉蒸干后，提取物溶于4%氯化鈉溶液，經正己烷去脂，液液分配凈化。再加BSTFA-TMCS衍生化反應后氮氣吹干，正己烷定容進樣分析，外標法定量。結果表明，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素在0.1～20 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數r2≥0.9989；空白樣品加標實驗表明，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素在1、5、10 μg/kg這3個添加水平下的回收率為62.9%～100.8%，RSD<16%，其檢出限分別為 0.05、0.1、0.1 μg/kg。該方法簡便快捷，準確度和精密度高，適用于地龍、水蛭中氯霉素類藥物的殘留測定。

中藥材；地龍；水蛭；氯霉素類藥物；殘留量；氣相色譜

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)、甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)、氟甲砜霉素(又稱氟苯尼考，Florfenicol，FF)同屬于氯霉素類廣譜抗生素，在畜牧業、漁業中廣泛應用。但研究發現氯霉素存在嚴重的毒副作用，可引起人類的再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏癥、新生兒和早產兒灰色綜合癥等疾病，低濃度的藥物殘留還會誘發致病菌的耐藥性[1]。甲砜霉素是氯霉素的類似物，被稱為第二代氯霉素，氟甲砜霉素是甲砜霉素的氟化衍生物，被稱為第三代氯霉素，這兩種藥物有效地克服了氯霉素導致再生障礙性貧血的缺陷[2]。但甲砜霉素有比氯霉素強5倍的免疫抑制作用，且抗菌效果不及氯霉素和氟甲砜霉素，因此限制了它的臨床使用[3]。氟甲砜霉素的毒副作用較小，在獸醫臨床上應用廣泛[4]。

目前，對以上3種藥物殘留量的檢測方法主要有氣相色譜法、氣-質聯用法、高效液相色譜法、液-質聯用法、酶聯免疫法[5-12]等，檢測對象主要包括肉類、乳制品、水產品、禽畜飼料、土壤及禽畜糞[5-12]等。由于地龍主食發酵的雞糞、豬糞、牛羊糞和生活垃圾[13]，水蛭主食螺螄、河蚌、青蝦、龜鱉、蚯蚓、草蝦以及哺乳類動物的血液[14]，故地龍、水蛭體內也可能有氯霉素類藥物殘留。加之目前對動物源性中藥材中氯霉素類藥物的殘留檢測鮮有報道，本試驗選取地龍、水蛭兩味中醫臨床常用且療效顯著的中藥材，測定其中氯霉素類藥物的殘留量，這既可保障人民用藥安全，亦對兩味藥材的進出口貿易意義重大。

1 材 料

1.1 儀器與設備 Agilent 7890A氣相色譜儀(配μ-ECD檢測器)，色譜柱為毛細管色譜柱(Agilent HP-5，30 m×0.32 mm ×0.25 μm)，載氣為高純氮氣(純度≥99.999%，北京氦普北分氣體工業有限公司)；HGC-12A氮吹儀(天津市恒奧科技發展有限公司)；HEI-VAP型旋轉蒸發器(德國海道夫)；HH-22恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)；TP-150超聲波清洗機(北京天鵬電子新技術有限公司)；SHB-B循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；80-2型高速離心機(江蘇省金壇市醫療儀器廠)；WH-1渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠)；PL203/01電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Eppendorf單通道可調移液槍(10～100μL、20～200μL、100～1000μL)；C18固相萃取小柱(1000 mg/6 mL填料，德國CNW公司)；Florisil固相萃取小柱(1000 mg/6 mL填料，美國Agilent公司)等。

1.2 藥品與試劑 氯霉素標準品(純度99.3%，中國藥品生物制品檢定所)；甲砜霉素標準品(純度99.7%，中國藥品生物制品檢定所)；氟甲砜霉素標準品(純度99.3%，中國藥品生物制品檢定所)；N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)：純度98%，阿拉丁試劑；三甲基氯硅烷(TMCS)：純度98%，國藥集團；色譜純甲醇(4 L/瓶，Fisher公司)；分析純甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、乙醚、吡啶、甲苯、無水硫酸鈉、氯化鈉(北京化工廠)等。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制 參照農業部958號公告-14-2007《水產品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留量的測定氣相色譜-質譜法》配制100 μg/mL氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標準儲備溶液，10 μg/mL氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標準儲備溶液，0.2 μg/mL氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合標準使用溶液，4%氯化鈉溶液及BSTFA-TMCS(體積比為99∶1)衍生化試劑。

2.2 樣品前處理

2.2.1 樣品的提取 準確稱取2.0 g樣品于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL乙酸乙酯，超聲提取30 min，靜置，過濾，濾渣重復上述操作一次，合并兩次濾液至100 mL茄形瓶中，40 ℃水浴旋轉濃縮至干，加入5 mL 4%的氯化鈉溶液超聲，將溶液轉移至10 mL具塞玻璃試管中，加入5 mL正己烷，渦旋，將試管置離心機中，以3000 r/min離心10 min，取出試管，棄掉正己烷層，以去除脂肪，重復操作一次。

2.2.2 樣品的凈化 向除去脂肪、蛋白質的氯化鈉水溶液中加入5 mL乙酸乙酯渦旋，靜置分層，吸取有機相至10 mL具塞玻璃試管中，再分別用3、2 mL乙酸乙酯提取兩次，合并有機相，過裝有5 g無水硫酸鈉的小柱，以除去水分，再用5 mL乙酸乙酯洗滌無水硫酸鈉的小柱，合并洗脫液至50 mL茄形瓶中，40 ℃水浴濃縮至近干，加入1 mL乙酸乙酯溶解茄形瓶中的殘渣并轉移至5 mL刻度試管中，再用2 mL乙酸乙酯清洗茄形瓶，清洗液亦轉移至5 mL刻度試管中，50 ℃下氮氣吹干待衍生化。

2.2.3 樣品的衍生化 取上述吹干后待衍生化的殘渣加入100 μL衍生化試劑BSTFA-TMCS與100 μL反應介質吡啶，70 ℃水浴加熱60 min進行衍生化反應，反應完成后氮氣吹干，放至室溫用正己烷定容至1 mL，轉移至2 mL進樣小瓶中，待GC檢測。

2.3 色譜測定條件 Agilent HP-5毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序：80 ℃保持1 min，50 ℃/min升溫至200 ℃，20 ℃/min升溫至260 ℃保持5 min，5 ℃/min升溫至280 ℃；進樣口溫度為250 ℃；載氣為高純氮氣，流速1 mL/min；檢測器溫度為300 ℃；進樣量為1 μL，不分流進樣。混合標準品和樣品色譜圖見圖1、圖2。

B.地龍空白樣品色譜圖;C.地龍加標樣品色譜圖圖1 氯霉素類藥物混合標準品溶液(A)和地龍樣品(B、C)氣相色譜圖

B.水蛭空白樣品色譜圖;C.水蛭加標樣品色譜圖圖2 氯霉素類藥物混合標準品溶液(A)和水蛭樣品(B、C)氣相色譜圖

2.4 線性關系考察 用2.1.3混合標準使用溶液分別配制出0.1、1、5、10、20 μg/L的混合標準溶液，將不同濃度的混合標準溶液按2.2.3項下衍生化后，按2.3項下條件進行GC-ECD測定。以峰面積Y為縱坐標，以試樣濃度X(μg/L)為橫坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，得氯霉素的回歸方程為：Y=103.92X-57.791，r2=0.9993，氟甲砜霉素的回歸方程為：Y=32.945X+31.982，r2=0.9989，甲砜霉素的回歸方程為：Y=81.725X-249.37，r2=0.9990。表明本方法氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素在0.1～20 μg/L濃度范圍內線性關系良好。2.5 準確度和精密度考察 分別準確稱取空白本底的地龍、水蛭樣品2.0 g于100 mL具塞錐形瓶中，加入濃度分別為1、5和10μg/L的3種氯霉素類藥物混合標準品溶液2 mL(精密量取)，充分混勻，放置過夜。使空白樣品中氯霉素類藥物的添加水平為1、5、10 μg/kg 3個水平(每個水平3個平行)。按照2.2樣品前處理及2.3色譜測定條件進行測定，計算加標回收率和相對標準偏差，結果見表1。

由表1可知，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素在1、5、10 μg/kg 3個添加水平下的回收率為62.9%～100.8%，RSD<16%，符合氯霉素類藥物殘留測定的要求。

表1 地龍、水蛭中三種不同濃度氯霉素類藥物混合標準溶液添加回收率(n=3)

2.6 檢出限和定量限的確定 分別取地龍、水蛭空白樣品，按照樣品前處理程序處理后上機測定，另取多份空白樣品，分別加入不同的較低濃度的氯霉素類藥物混合標準工作液，按照樣品前處理程序處理后上機測定，對比兩者，S/N=3時的藥物濃度即為檢出限，S/N=10時的藥物濃度即為定量限。本試驗所建立的檢測方法測得氯霉素的檢出限和定量限分別為0.05、0.17 μg/kg，甲砜霉素、氟甲砜霉素的檢出限和定量限分別為0.1、0.33 μg/kg。

2.7 樣本測定結果 從北京10家藥店隨機購買樣本10份，均未檢出氯霉素類藥物。

3 討論與分析

3.1 提取溶劑的選擇 氯霉素類藥物為弱極性物質，微溶于水，易溶于乙腈、甲醇、丙酮和乙酸乙酯等有機溶劑，甲醇、乙腈這兩種溶劑對人體毒性較大，而且乙腈在揮干時容易冒泡，揮干時間較長[5，15-16]，參考《GB/T 22338-2008 動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》中氣相色譜-質譜法，本試驗選擇乙酸乙酯作為提取劑。

3.2 凈化方式的選擇 李鵬等[7]測定動物組織中氯霉素類藥物殘留量時采用Florisil柱凈化，農業部958號公告-14-2007《水產品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留量的測定氣相色譜-質譜法》采用C18固相萃取柱凈化，吳明媛[6]、冷凱良等[17]采用乙酸乙酯反萃取凈化。本試驗對3種凈化方法均進行了試驗，結果顯示采用Florisil SPE柱凈化時氯霉素類藥物的回收率比較低，采用C18 SPE柱和乙酸乙酯液液萃取凈化時氯霉素類藥物的回收率均在75%以上。綜合樣品凈化的回收率結果、操作的簡便性和耗材費用等方面的因素，確定地龍藥、水蛭藥材中3種氯霉素類藥物殘留測定方法中樣品的凈化方法為：用10 mL乙酸乙酯分3次(5 mL+3 mL+2 mL)萃取凈化。

3.3 藥材樣本的測定 在對10批地龍、水蛭樣本的測定中，未檢出氯霉素類藥物的殘留，參照中華人民共和國農業部2002年235號公告《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》中的規定：氯霉素為禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出；甲砜霉素最大殘留限量為50 μg/kg；氟甲砜霉素在其他動物的肌肉中的最大殘留限量為100 μg/kg。本批樣本氯霉素類藥物的殘留符合規定。但值得注意的是，研究著重于建立一種測定動物源性中藥材地龍、水蛭中3種氯霉素類藥物殘留量的方法，所測的地龍、水蛭樣本數量不足，因此要想全面了解地龍、水蛭中氯霉素類藥物的殘留情況，還需增加對不同品種、不同地區和不同炮制方式等更多樣本的測定。

4 小 結

建立了GC-ECD法同時測定動物源性中藥材地龍、水蛭中3種氯霉素類藥物殘留量的方法，本法靈敏度高，氯霉素的檢出限可達到0.05 μg/kg，甲砜霉素和氟甲砜霉素的檢出限可達到0.1 μg/kg。該方法前處理步驟相對簡單，處理后雜質干擾少，具有較強的適用性。

[1] 高林．氯霉素的不良反應及其殘留檢測方法研究進展[J]．動物醫學進展，2010，31(4)：90-95．

[2] 李紅權，孫良娟，伍志強，等．高效液相色譜串聯質譜法同時測定飼料中氯霉素、甲砜霉素與氟甲砜霉素殘留[J]．中國實驗方劑學雜志，2012，,31(11)：1396-1400．

[3] 琚大偉，阮祥春，吳虹，等．甲礬霉素殘留檢測研究進展[J]．中國蜂業，2011，62(Z3)：56-60．

[4] 孫興南．氟苯尼考在基層動物診療應用中存在的問題及對策[J]．云南畜牧獸醫，2015，44(5)：33-34．

[5] 劉永濤，李榮，袁科平，等．氣相色譜法同時測定水產品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素殘留量[J]．淡水漁業，2007,37(2)：44-47．

[6] 吳明媛，楊姝麗，黎小正，等．毛細管電子捕獲氣相色譜法同時測定水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留[J]．廣西農業科學，2009，40(5)：567-570．

[7] 李鵬，邱月明，蔡慧霞，等．氣相色譜-質譜聯用法測定動物組織中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素的殘留量[J]．色譜，2006，24(1)：14-18．

[8] 曾芳，黃玉芬，劉忠珍，等．高效液相色譜法測定土壤和畜禽糞中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素[J]．廣東農業科學，2010，37(10)：38-40．

[9] 潘曉東，吳平谷，姜維．超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定魚肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素[J]．中國食品衛生雜志，2014，26(6)：572-574．

[10]胡雪，李翠枝，劉麗君，等．UPLC-MS-MS法測定飼料、原料乳及乳制品中3種氯霉素類藥物殘留[J]．食品科學，2014，35(16)：110-113．

[11]周曉芳，張淑萍，王僧虎，等．ELISA方法檢測氯霉素的質量評價[J]．北京農學院學報，2010，25(4)：1-3．

[12]劉智宏，黃耀凌，汪霞，等．水產品中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺酶聯免疫多殘留測定[J]．中國獸藥雜志，2010，44(12)：1-5．

[13]劉紅軍，尹文生．蚯蚓養殖技術與加工利用[J]．現代農業科技，2016，23(1)：9296-9297．

[14]常東洲，李同國．水蛭的生物學習性及人工養殖技術[J]．科學養魚，2000，15(12)：18．

[15]劉耀川，趙剛，劉軍驊，等．氟苯尼考的研究進展及應用[J]．現代畜牧獸醫，2011，40(2)：44-46．

[16]李佩佩，張小軍，梅光明，等．超高效液相色譜-串聯質譜法檢測漁用飼料中氯霉素類藥物[J]．中國漁業質量與標準，2013，3(3)：44-50．

[17]冷凱良，孫偉紅，王志杰，等．GC/MS 法同時測定水產品中氯霉素、氟甲砜霉素及甲砜霉素殘留量[J]．海洋水產研究，2007，28(5)：95-99．

(編輯：陳希)

Determination of 3 Chloramphenicols Medicine Residuesin Animal-origin Chinese Medicinal Materials Pheretima and Hirudoin the Retailer by Gas Chromatography

WANG Peng-si1，LI Jia-xin1，SHI Shang-mei2*，XUE Jian1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.ChinesePharmacopoeiaCommission，Beijing100061，China)

Pre-column derivatization GC-ECD method was established to simultaneously determine the residues of chloramphenicol(CAP)，thiamphenicol(TAP) and florfenicolin(FF) in animal-original Chinese medicinal materials pheretima and hirudo in the retailer．The samples were extracted with ethylacetate by ultrasound assistance and evaporated to dry．The extracts were dissolved in 4% sodium chloride solution，defatted with n-hexane，and cleaned up by liquid-liquid partition．The purified extracts were derivatized with BSTFA-TMCS and derivatization solution was dried under nitrogen．The final targets were dissolved with n-hexane and quantitatived by external standard method．The results indicated that the calibration curves of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol were linear in the ranges of 0.1～20 μg/L，with correlation coefficients not less than 0.9989.Recoveries of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol spiked in blank samples at three levels of 1，5，10 μg/kg were 62.9%～100.8%，and the relative standard deviation(RSD) was less than 16%，the limits of detection(LODs)were 0.05，0.1，0.1 μg/kg respectively．With the advantages of simplicity，rapidity，high accuracy and precision，this method could be suitable for the detection of chloramphenicols medicine residues in pheretima and hirudo．

Chinese medicinal materials；pheretima；hirudo；chloramphenicols medicine；residues；gas chromatography

王鵬思，碩士研究生，從事中藥質量方面研究。

石上梅，E-mail:ssm@chp.org.cn；薛健，E-mail:xuejian200@sina.com

2016-10-28

A

1002-1280 (2017) 03-0065-05

S853.7