五加芪粉對小鼠淋巴細胞增殖功能和抗體形成細胞的影響

桑卡娜，高艷艷，周德剛

(國家獸用藥品工程技術研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽471003)

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五加芪粉對小鼠淋巴細胞增殖功能和抗體形成細胞的影響

桑卡娜，高艷艷，周德剛

(國家獸用藥品工程技術研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽471003)

為了考察五加芪粉對小鼠淋巴細胞增殖功能和抗體形成細胞的影響，為臨床應用提供理論依據，設不同劑量的(60、120、240 mg·kg·d-1)五加芪粉組，同時設黃芪多糖粉對照組和空白對照組。連續灌胃7 d后，無菌取小鼠脾臟，制備脾淋巴細胞，采用MTT法檢測小鼠淋巴細胞增殖功能，定量溶血分光光度(QHS)法測定小鼠抗體形成細胞。結果顯示：五加芪粉中、高劑量組可顯著(0.01

五加芪粉；淋巴細胞增殖；抗體形成細胞；小鼠

五加芪粉主要成分為黃芪和刺五加，黃芪主要活性成分為黃酮、皂苷和黃芪多糖(APS)。總黃酮對小鼠具有免疫增強和調節作用。黃芪皂苷可保護心肌、增強心肌收縮力，改善心功能。黃芪多糖具有多重功效，可以提升動物機體的免疫力、抗病力、降低發病率[1]、有抗腫瘤、抗病毒[2]、抗氧化、抗衰老作用[3]、同時可以保肝護腎、調節血糖[4]、補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌[5]，其中以免疫調節功能最為突出，能增強細胞免疫和體液免疫的免疫功能[6]。

刺五加主要活性成分為黃酮、苷類、多糖等，其多糖是干擾素促誘生劑，通過提高干擾素的水平，提高機體免疫力[7]。黃芪和刺五加有相互協同的藥理作用，都能增強機體免疫力，配合疫苗使用可提高疫苗的免疫效果。

脾臟作為重要的外周免疫器官，含有T淋巴細胞和B淋巴細胞，其中T淋巴細胞主要參與細胞免疫，B細胞主要參與體液免疫。本研究通過無菌制備脾臟淋巴細胞懸液，采用MTT法和定量溶血分光光度測定(QHS)法分別檢測小鼠脾臟T淋巴細胞體外增殖功能和B淋巴細胞功能。通過體液免疫和細胞免疫兩方面探討五加芪粉對機體免疫功能的影響，為其基礎研究和臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 試驗動物 6周齡的BALB/C小鼠120只，SPF級，雌雄各半，體重18～22 g，8周齡豚鼠6只，SPF級，雄性，體重250～300 g；均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 試驗藥品 五加芪粉：規格50 g:165 g生藥，批號20120203，由洛陽惠中獸藥有限公司提供；黃芪多糖粉：每1 g含黃芪多糖≥450 mg，批號1107121，愛迪森(北京)生物科技有限公司。

1.3 主要試劑 RPMI-1640培養基，批號：1042186，Invitrogen公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，批號：MKBH7489V，Sigma公司；胎牛血清，批號：NSF0051，海克隆生物化學制品(北京)有限公司；脫纖維綿羊血，批號：20140310，鄭州益康生物工程有限公司。

1.4 主要儀器 8000WJ-3423 CO2培養箱：美國Thermo公司；37XB生物顯微鏡：上海光學儀器六廠；Sunrise酶標儀：瑞士Teacan公司；Nu-425-400S生物安全柜：美國Nuaire公司；TGL-16G臺式高速離心機：江蘇金壇市科興儀器廠。

2 方法

2.1 試劑配制

2.1.1 綿羊紅細胞懸液的制備 取脫纖維綿羊血20 mL，2500轉/min離心10 min，棄上清。加PBS液10 mL，重懸，重復洗滌3次后加入PBS液，配制10%和0.2%的綿羊紅細胞懸液。

2.1.2 補體的制備 取8 mL豚鼠血清加入2 mL壓縮體積的綿羊紅細胞，混勻，4 ℃冰箱放置1 h，2500轉/min離心5 min，取上清，用PBS液進行20倍稀釋，備用。

2.2 試驗設計與分組 挑選體重在18～22 g的小鼠100只，隨機分為5組，每組20只，雌雄各半，具體分組見表1。五加芪組小鼠每日灌服0.2 mL濃度為6、12、24 mg/mL五加芪溶液1次，黃芪多糖組每日灌服0.2 mL濃度為12 mg/mL黃芪多糖溶液1次，空白組灌服等量的純化水，連續7 d。

表1 試驗分組和給藥劑量

2.3 MTT法測定淋巴細胞增殖試驗2.3.1 脾臟淋巴細胞懸液的制備 第7次給藥后24 h，頸椎骨脫位法處死小鼠，每組10只，雌雄各半。酒精浸泡消毒后無菌取脾臟，D-Hank’s液漂洗后置于200目的無菌尼龍網上，用無菌玻璃針芯研磨，加D-Hank’s液過濾，2000轉/min離心5 min，去上清。加入4 mL紅細胞裂解液重懸，置于37 ℃培養箱內孵育10 min，2000轉/min離心5 min，去上清。用D-Hank’s液和完全1640培養液重復離心洗滌1次。用0.5%臺盼藍染色，取10 μL加入細胞計數板內于顯微鏡下觀察，當細胞存活率在90%以上，且計數區域內細胞分布均勻，時，計數四個大方格內的活細胞數，根據以下公式計算每毫升細胞懸液中的活細胞濃度。根據計數結果，用完全1640培養液將細胞濃度調至1.5×106/mL。

細胞濃度(個/mL)=4個大方格中的細胞數/4×稀釋倍數×104

2.3.2 淋巴細胞增殖試驗 采用MTT法測定淋巴細胞增殖。取分離得到的淋巴細胞于96孔板中，37 ℃、5%CO2條件下培養48 h。在培養44 h后，每孔各加入5 mg/mL 的MTT10 μL(初始濃度為)繼續培養4 h。培養結束后，每孔吸取上清液150 μL棄去，然后加入150 μL的DMSO，置微量振蕩儀振蕩10 min，使紫色結晶完全溶解，用酶標儀測定570 nm波長下OD值，作為T淋巴細胞增殖的指標。

2.4 小鼠的抗體形成細胞試驗

2.4.1 動物的免疫 第7日給藥后，每組取10只小鼠，雌雄各半，每只小鼠腹腔注射10%的綿羊紅細胞0.5 mL。

2.4.2 脾臟淋巴細胞懸液的制備 免疫后第6日，頸椎脫臼處死免疫后的各組小鼠，常規取脾臟，分離脾淋巴細胞，并進行細胞計數，調整細胞濃度至5.0×106/mL。

2.4.3 脾細胞介導綿羊紅細胞定量溶血分光光度試驗(QHS) 取小鼠脾臟淋巴細胞懸液1 mL，補體1 mL，0.2%綿羊紅細胞(SRBC) 1 mL，混勻，37 ℃水浴1 h，1500轉/min離心10 min，取上清液200 μL加入96孔細胞培養板，用酶標儀測定其在413 nm波長處吸光度值，作為QHS反應值。

3 結果與分析

3.1 MTT法測定淋巴細胞增殖試驗 五加芪粉對小鼠淋巴細胞增殖試驗各組淋巴細胞增殖結果見表2。從表2可以看出，給藥各組與空白對照組相比，小鼠脾臟淋巴細胞的吸光度值均有不同程度的增高。其中，五加芪粉中劑量組、黃芪多糖粉對照組與空白對照組比，差異顯著(0.01

組別組名570nm的吸光度值與黃芪多糖粉對照組相比P值與空白對照組相比P值1五加芪粉低劑量組0.277±0.0270.1010.4152五加芪粉中劑量組0.299±0.0370.9150.021*3五加芪粉高劑量組0.311±0.0260.4270.002**4黃芪多糖粉對照組0.300±0.035—0.016*5空白對照組0.265±0.0300.016*—

表中“*”表示與空白對照組相比差異顯著(0.01

3.2 小鼠抗體形成細胞的影響 五加芪粉對小鼠抗體形成細胞的影響試驗采用定量溶血分光光度法(QHS)對小鼠的QHS的影響結果見下表3。從表3可以看出，與空白對照組相比，五加芪粉各劑量組與黃芪多糖粉對照組脾細胞介導綿羊紅細胞定量溶血分光光度值均有明顯的增高。其中，五加芪粉低劑量組、黃芪多糖粉對照組與空白對照組比，差異顯著(0.01

組別組名413nm吸光度值與黃芪多糖粉對照組相比P值與空白對照組相比P值1五加芪粉低劑量組0.522±0.0740.9510.036*2五加芪粉中劑量組0.549±0.1070.5420.007**3五加芪粉高劑量組0.562±0.0890.3380.003**4黃芪多糖粉對照組0.525±0.060—0.031*5空白對照組0.438±0.0960.031*—

4 討論與小結

中藥黃芪和刺五加都具有提高機體免疫力的功效，試驗主要研究黃芪和刺五加提取的五加芪粉，通過采用MTT法測定淋巴細胞增殖功能，反應細胞免疫功能，QHS法測定小鼠的抗體形成細胞，反應體液免疫功能。

脾臟淋巴細胞增殖功能的高低反映了機體細胞免疫功能的狀態。ConA(刀豆蛋白A)可誘導小鼠脾臟淋巴細胞增殖，ConA促進有絲分裂，能選擇性的作用于T細胞。參與細胞免疫，促進其增殖轉化。五加芪粉灌胃后，小鼠脾臟淋巴細胞增殖的吸光度值與增殖能力呈正比，吸光度值增高，對ConA的刺激反應增強，表明五加芪粉具有促進細胞免疫功能的作用。劉永杰等[7]研究發現雛雞注射黃芪多糖后，淋巴細胞增殖反應均增加或顯著增加，說明黃芪多糖能明顯提高機體免疫功能。王遠閣等[8]研究黃芪多糖(APS)、牛膝多糖(ABPS)、板藍根多糖(IRPS)、山藥多糖(DOPS)等4種中藥多糖用MTT法測定淋巴細胞增殖的變化。結果表明4種多糖在適宜的濃度下均能促進淋巴細胞增殖作用。

以上文獻報道與本試驗結果一致，均表明多糖類成分能明顯協同ConA刺激淋巴細胞增殖，促進白細胞介素-2 (IL-2)產生及協同細菌脂多糖(LPS)的作用，同時能增強B淋巴細胞和巨噬細胞的功能，增強正常小鼠外周血NK細胞的活性，刺激NK細胞增殖，對小鼠的免疫功能具有較好的促進作用。

體液免疫是機體特異性免疫的重要組成部分，負責體液免疫的細胞是B細胞。脾細胞介導綿羊紅細胞定量溶血分光光度值的高低反映了脾臟中B細胞分泌抗體的能力，是評價動物機體體液免疫功能的重要指標。五加芪粉各劑量組可提高脾細胞介導綿羊紅細胞定量溶血分光光度值，表明五加芪粉具有提升動物體液免疫能力的作用。王志強[9]等采用定量溶血分光光度測定法(QHS)體外測定B細胞產生分泌抗體水平，結果表明黃芪能增強小鼠抗體形成細胞活性，促進B細增殖。高春艷[10]等研究結果表明復方黃芪煎劑可以明顯提高小鼠脾臟抗體形成細胞(PFC)的數量，具有改善體液免疫功能的作用。以上文獻資料報道與本試驗結果一致，均表明多糖類中藥能增強小鼠抗體形成細胞(B細胞)活性，促進B細胞分化、增殖為漿細胞，同時可增加脾臟重量，促進免疫細胞的分裂繁殖，明顯增強小鼠抗體形成，對體液免疫和細胞免疫功能有促進作用。

隨著畜牧養殖業的迅速發展和集約化養殖的增加，畜禽的疾病也越來越復雜，由于頻繁和不正當的使用抗生素進行病菌感染的治療和預防，導致耐藥性和藥物殘留問題，嚴重危害環境和人類健康。我國中藥資源豐富，研究歷史深遠，由于中藥具有毒性小、無耐藥性等優勢，采用中藥制劑對畜禽疾病進行預防治療，意義深遠。本試驗通過研究中藥五加芪粉對小鼠淋巴細胞增殖和抗體形成細胞水平的影響，表明五加芪粉可提高機體細胞免疫和體液免疫功能，具有提升機體免疫力的作用。

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(編輯：陳希)

Influence of Wujiaqi Powder on Lymphocyte Proliferation and Antibody-Forming Cells of Mice

SANG Ka-na，GAO Yan-Yan，ZHOU De-gang

(LuoyangHuizhongAnimalMedicineCo.，Ltd，NationalResearchCenterforVeterinaryMedicine，Luoyang，Henan471003，China)

Explored the effect of Wujiaqi powder on lymphocyte proliferation and antibody-forming cells of mice, and to provide theoretical basis for clinical application．Three groups of Wujiaqi powder with different doses(60, 120, 240 mg·kg·d-1) were explored and with the astragalin polysaccharides group and blank group as control group. After 7 d of continuous intragastrical administration and spleen lymphocytes cells were prepared by aseptic separation.Using MTT to measure the proliferations of T lymphocytes,and (QHS)to analyze antibody-forming cells. The results show that: themiddle and high dose groups of Wujiaqi powder can significantly(0.01

Wujiaqi powder; lymphocyte proliferation; antibody -forming cells; mice

桑卡娜，碩士，從事新獸藥藥效評價工作。E-mail：kanasanglp@163.com

2016-12-05

A

1002-1280 (2017) 03-0044-04

S853.74