吉林省犬細小病毒流行毒株的分離及VP2基因序列分析

張雙，伊淑帥，王一鳴，郭夢茹，李響，胡桂學*

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118；2.松原出入境檢驗檢疫局，吉林松原 138000)

?

吉林省犬細小病毒流行毒株的分離及VP2基因序列分析

張雙1，伊淑帥1，王一鳴1，郭夢茹1，李響2，胡桂學1*

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118；2.松原出入境檢驗檢疫局，吉林松原 138000)

為了解吉林省寵物醫院就診犬犬細小病毒流行現狀及毒株變異情況，從吉林省長春、吉林、遼源、松原、九臺地區采集就診犬肛門拭子73份，采用膠體金快速檢測試劑盒檢測后，陽性樣品15份。選取具有代表性的6份病料使用F81細胞進行病毒的分離，成功分離到6株病毒(暫命名為JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-JT、JL-LY)，經通用引物鑒定均為犬細小病毒。VP2基因序列分析結果顯示，6株CPV分離株之間的核苷酸同源性為99.3%～100%，與近年來國內分離株核苷酸同源性為98.9%～99.9%，與國外分離株核苷酸同源性為98.3%～99.7%。遺傳進化樹結果表明，6株分離株分屬4個分枝：JL-CC1、JL-LY、JL-SY與山東、遼寧分離株同屬1個分枝，JL-CC2與黑龍江分離株同屬1個分枝，JL-JT與吉林分離株同屬1個分枝，JL-JL與2013年吉林、黑龍江分離株同屬1個分枝。氨基酸序列比對顯示6株分離株JL-CC1、JL-CC2、JL-JT、JL-LY、JL-SY屬于New CPV-2a基因亞型，JL-JL株為屬于New CPV-2b基因亞型。此外，6株CPV分離株在267、324、377、440位氨基酸發生了變異。結果表明，吉林省CPV以CPV-2a亞型為主，CPV-2b亞型為輔，并存在基因多變現象，可為吉林省CPV的有效防控提供數據支持。

吉林省；犬細小病毒；分離；VP2基因

犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canine parvovirus, CPV)感染引起的一種犬急性高度接觸性傳染病，主要感染幼犬，臨床癥狀表現為嘔吐、腹瀉、出血性腸炎以及白細胞顯著減少。自1977年美國科學者Eugstet等首次從患病犬糞便中觀察到CPV后，加拿大、日本、法國、德國、韓國等國家先后報道了本病的發生[1-2]。我國首次于1982年由梁世哲等報道了本病的發生，并于次年由徐漢坤等確定了本病在我國的流行[3]。目前，CPV已呈世界性流行，對寵物犬健康以及毛皮動物養殖業造成了嚴重的威脅。

CPV隸屬于細小病毒科，細小病毒屬，為單股正鏈DNA病毒。病毒粒子為等軸對稱的二十面體結構，直徑為20～24 nm，由衣殼和核酸組成，病毒無囊膜。CPV病毒粒子結構堅實致密，對外界環境抵抗力強。CPV基因組長約5200 nt，分子量為1.7×106，其基因組中包含2個啟動子，利用宿主的RNA聚合酶Ⅱ分別啟動結構蛋白(VP1, VP2)和非結構蛋白(NS1, NS2)編碼基因的轉錄[4-6]。CPV只有一個抗原型，與FPV、MEV同源性較近，序列分析表明FPV與CPV的基因組差異不到1%，但宿主范圍、血凝性、抗原性等存在著明顯的差異。CPV可以通過基因漂移不斷進化，隨時間發生基因突變，CPV已由最初分離的CPV-2亞型，變異為CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)5中基因亞型。其變異的主要特征為VP2蛋白第426位氨基酸的變異，426-天冬酰胺(Asn)為CPV-2與CPV-2a亞型，變異為天冬氨酸(Asp)，則為CPV-2b亞型，變異為谷氨酸(Glu)，則為CPV-2c亞型[7]。目前，中國流行的主要為CPV-2a、CPV-2b亞型，2010年報道CPV-2c亞型的感染，但未形成大的流行[8]。為了解吉林省寵物醫院就診犬CPV流行毒株的變異情況及基因亞型分布情況，本試驗采用膠體金快速診斷試劑盒對長春、吉林、九臺等5個地區寵物醫院就診犬病例進行了檢測，并對CPV陽性病例進行了病毒分離與VP2基因測序及分析，以了解吉林地區CPV的分子流行病學與VP2基因遺傳變異情況，以期為本地CPV的有效防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 毒株及細胞株 CPV陽性毒株為吉林農業大學預防獸醫學實驗室保存；F81細胞為軍事獸醫研究所饋贈。

1.2 主要試劑與儀器 犬細小膠體金快速檢測試劑盒購于意大利KoQine公司；Virus Genomic DNA Kit，Gel Extraction kit，Plasmid Mini Preparation kit購自Axygen公司；Ex Taq酶、10×buffer、dNTP、PMD-18T、DL 2000 maker等均購自TAKARA公司；MEM、0.05%胰酶、雙抗、胎牛血清購自gibco公司。MikRo 22R高速冷凍離心機(德國HETTICH公司)、MIR-162 CO2恒溫培養箱(日本SANYO公司)、TC-25/H PCR儀(BIOER公司)、DYY-6B電泳儀凝膠成像系統(BIO-RAD公司)等。

1.3 病料來源及處理 病料采集自2015-2016年吉林省長春、吉林、松原、九臺、遼源5個地區寵物醫院就診的寵物犬，為患病犬的糞便樣本。采集的糞便樣本中加入含有1%雙抗溶液的MEM渦旋混勻，反復凍融3次后，5000 r/min離心5 min，收集上清液10000 r/min離心5 min，再次收集上清液于新的離心管中，處理后的樣本于-80 ℃保存。

1.4 犬細小膠體金試紙條檢測 病料處理液使用KoQine公司的犬細小膠體金快速檢測試劑盒進行檢測，并設置陽性對照與陰性對照。

1.5 病毒分離 膠體金快速檢測試劑盒檢測結果為陽性的病料處理液經0.22 μm濾膜過濾除菌，按培養液體積的1/10接種于F81細胞，同時設置對照組，37 ℃吸附1 h，補充細胞維持液，37 ℃、5% CO2溫箱中靜置培養4～5 d，每日觀察細胞病變情況。若無病變則于培養4～5 d后收集培養液，按照常規方法進行盲傳，盲傳5代后無病變則視為陰性；出現病變的細胞經反復凍融3次后收集病毒液，-80 ℃保存。

1.6 犬細小通用引物鑒定 使用Virus Genomic DNA Kit提取出現典型犬細小CPE的病毒液DNA，以病毒DNA為模板，去離子水、CPV陽性毒株DNA為陰、陽對照，使用CPV通用引物進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.7 VP2全基因擴增及序列分析 根據NCBI上已發表的CPV-2株(GenBank登錄號：M38245)基因序列設計擴增VP2全基因序列的引物，引物序列為VP2-F: 5’-ATGAGTGATGGAGCAGTTC-3’，VP2-R: 5’-AATATAATTTTCTAGGTGCTAG-3’，預期擴增片段大小為1755 bp。擴增條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min 45 s，72 ℃終延伸10 min，共35個循環。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，經膠回收后連接pMD-18T載體，轉化DH5α感受態大腸桿菌，挑取陽性菌落提取質粒，并送往上海生工有限公司測序。查找GenBank上已發表的國內外不同基因型的CPV毒株VP2基因序列，使用MEG7.0軟件進行基因序列及氨基酸序列同源性分析，并繪制進化樹。

2 結 果

2.1 膠體金試劑盒檢測結果 本試驗共采集患病犬糞便樣本73份，經犬細小膠體金快速診斷試劑盒檢測，CPV陽性樣品15份，分別為長春6份、吉林3份、松原2份、九臺2份、遼源2份。

2.2 病毒分離 選擇具有代表性的6份膠體金檢測陽性臨床樣品處理液，接種單層培養的F81細胞，并觀察細胞病變。6份臨床樣品均于接毒后48～96 h細胞出現腫脹圓縮、拉網、脫落典型的細胞病變，對照組細胞正常(圖1)。連續盲傳3代，出現穩定的細胞病變，證明成功分離到6株病毒，暫命名為JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-JT、JL-LY。

A：接毒組細胞腫脹圓縮、拉網、脫落；B：對照組細胞無病變圖1 接毒后細胞病變

2.2 犬細小通用引物鑒定結果 采用犬細小病毒通用引物對提取的病毒液DNA進行特異性擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均在845 bp左右出現目的條帶，與預期結果一致(圖2)。經序列測定及在線Blast比對，與CPV同源性為98.3%～99.9%，確定分離到的6株病毒均為CPV。

2.3 VP2全基因擴增結果 采用設計的VP2全基因引物VP2-F/VP2-R對6株CPV分離株的VP2基因進行特異性擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均在1755 bp左右出現目的條帶，與預期結果一致(圖3)。

2.4 VP2基因遺傳進化分析 CPV分離株VP2基因經PCR擴增、連接、轉化后，將陽性克隆質粒送往上海生工生物工程公司測序，測序結果經拼接后得到CPV分離株的VP2全基因序列，均為1755 bp。基于VP2基因遺傳進化分析結果表明，6株CPV分離株之間的核苷酸同源性為99.3%～100%，與近年來國內分離株核苷酸同源性為98.9%～99.9%，與國外分離株核苷酸同源性為98.3%～99.7%。其中，JL-CC1、JL-LY、JL-SY核苷酸同源性高達99.7%～100%；JL-CC2株與2013年黑龍江分離株核苷酸同源性達99.8%，JL-JT株與2008年吉林分離株核苷酸同源性達99.7%，JL-JL株與2013年吉林分離株核苷酸同源性達99.8%，6株CPV分離株與山東、遼寧等地方分離株核苷酸同源性也達到98.9%以上。查找GenBank上國內外不同基因型的CPV VP2基因序列，應用MEG 7.0軟件進行序列分析，并繪制遺傳進化樹(圖4)。

M：DL 2000Maker；1～6：JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-JT、JL-LY；7：陽性對照；8：陰性對照圖2 犬細小通用引物鑒定結果

M：DL 2000Maker；1～6：JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-JT、JL-LY；7：陰性對照圖3 CPV分離株VP2基因擴增結果

圖4 CPV VP2核苷酸序列遺傳進化樹(▲代表CPV分離株)

由圖可知，VP2基因遺傳進化樹分為2個大的分枝，分別為A分枝(主要包括本試驗6株分離株與山東、遼寧、吉林、黑龍江、印度以及韓國分離株)與B分枝(主要包括美國、法國分離的CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c毒株)。6株分離株分屬4個分枝：JL-CC1、JL-LY、JL-SY與山東、遼寧分離株同屬1個分枝，JL-CC2與黑龍江分離株同屬1個分枝，JL-JT與吉林分離株同屬1個分枝，JL-JL與2013年吉林、黑龍江分離株同屬1個分枝。

2.5 VP2基因推導氨基酸序列分析 根據CPV分離株VP2基因推導VP2氨基酸序列，共編碼584個氨基酸。比對6株分離株與GenBank中典型CPV基因型的氨基酸序列，分析CPV分離株基因變異位點(表1)。由代表CPV基因亞型的第87位、426位氨基酸可知，JL-CC1、JL-CC2、JL-JT、JL-LY、JL-SY均為426N，屬于New CPV-2a基因亞型，僅JL-JL株為426D，屬于New CPV-2b基因亞型。此外，6株CPV分離株在267、324、377、440位氨基酸發生了變異，主要表現為267: F→Y，324: Y→I，377: R→K，440: T→A，與中國分離株CPV/CN/HB1/2013、CPV/CN/JL6/2013等存在相同的變異，屬于一個特殊的分枝。

表1 CPV VP2基因推導氨基酸分析

3 討 論

犬細小病毒主要感染幼犬，幼犬感染CPV后發病率高達90%，病死率可達到20%～50%。不同年齡階段的幼犬感染后表現為不同的臨床癥狀，子宮內感染或8周齡以下幼犬感染多表現為心肌炎型，2～6月齡幼犬感染多表現為腸炎型[9]。此外，部分CPV毒株還可以感染貓科動物、貂等毛皮動物，對寵物犬貓健康以及毛皮動物養殖業造成了嚴重的威脅。CPV僅有一個血清型，但經過長期變異后形成不同的基因亞型，主要包括CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c。1978-1980年，主要為CPV-2基因型；1980年后，CPV-2 VP2蛋白發生了5個氨基酸的變異后成為CPV-2a亞型；1984年后，CPV-2a亞型VP2蛋白第426為氨基酸發生了變異進化為CPV-2b基因亞型；近年來，德國、阿根廷、南美等國家報道了CPV-2c基因亞型的出現[7, 10]。目前，世界范圍內主要流行的毒株為CPV-2a與CPV-2b亞型，但部分國家流行毒株則以CPV-2c亞型為主，如巴西、烏拉圭等國家[11]。據報道，我國目前流行的毒株主要為CPV-2a亞型，其次是CPV-2b亞型，2010年報道了CPV-2c亞型的發生，但未形成大規模流行。CPV的診斷臨床上主要依靠臨床癥狀的觀察以及生化、血常規、膠體金快速檢測試劑盒，實驗室診斷主要依靠病毒分離鑒定、PCR、LAMP等分子生物學檢測技術以及血凝試驗、ELISA等免疫學診斷方法[12]。病毒分離主要使用F81、MDCK、CRFK等細胞。基因型鑒定方法主要依據VP2基因，包括VP2全基因擴增與VP2基因可變區核酸PCR等方法，如Chinchkar等建立的VP2全基因擴增引物、Senda和Pereira等設計的CPV基因可變區PCR引物等[13-14]。本試驗采用膠體金試紙條對臨床樣本進行初步檢測，陽性樣品使用F81細胞進行病毒分離，成功分離到6株病毒，經CPV通用引物鑒定為CPV毒株，并暫命名為JL-CC1、JL-CC2、JL-JL、JL-SY、JL-BC、JL-LY。

使用設計的VP2全基因序列引物對6株CPV分離株VP2基因進行擴增、測序，并與國內外CPV分離株進行基因比對分析與推導氨基酸變異情況分析。VP2基因遺傳進化樹主要分為2個大的分枝：A分枝與B分枝，6株CPV分離株屬于A分枝，還包括2008-2014年我國山東、吉林、遼寧、黑龍江等地方分離株以及印度、韓國等亞洲分離株。B分枝主要包括美國、法國等歐美國家分離的不同基因亞型的CPV毒株。A分枝中，JL-CC1、JL-LY、JL-SY與山東、遼寧分離株同屬1個分枝，同源性高達99.7%～100%；JL-CC2株與2013年黑龍江分離株同屬1個分枝，核苷酸同源性達99.8%；JL-JT株與2008年吉林分離株同屬1個分枝，核苷酸同源性達99.7%；JL-JL株與2013年吉林分離株同屬1個分枝，核苷酸同源性達99.8%。經VP2基因推導氨基酸變異情況分析，6株分離株共存在6處變異，分別為267、300、324、377、426、440位氨基酸位點。其中，JL-CC1、JL-CC2、JL-JT、JL-LY、JL-SY426位氨基酸為天冬酰胺(N)，屬于New CPV-2a基因亞型，僅JL-JL株為天冬氨酸(D)，屬于New CPV-2b基因亞型。此外，6株CPV分離株在267、324、377、440位氨基酸發生了變異，主要表現為267: F→Y，324: Y→I，377: R→K，440: T→A，與中國分離株CPV/CN/HB1/2013、CPV/CN/JL6/2013等存在相同的變異。該變異已被相關文章報道過，中國、韓國、朝鮮等國家CPV分離株VP2蛋白第267、324、440位氨基酸與美國、歐洲等CPV分離株存在差異，形成了一個特殊的CPV分枝。丁軻等對2010-2013年河南省CPV流行毒株進行了分子流行病學調查，結果7株河南分離株VP2蛋白第267、322、324、333、440等11處氨基酸發生了變異，與本試驗變異情況相似。此外，調查結果證明河南省流行的CPV以CPV-2a型和CPV-2b型并存，但以CPV-2a型為主，且基因呈多變異現象[15]。通過本試驗對吉林省寵物醫院就診犬CPV流行毒株進行了分離及序列分析，結果提示吉林省CPV以CPV-2a亞型為主，CPV-2b亞型為輔，并存在基因多變現象，可為吉林省CPV的有效防控提供數據支持。

[1] Eugster A K, Bendele R A, Jones L P. Parvovirus infection in dogs [J]. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1978, 173(10): 1340-1345.

[2] Goddard A, Leise A L. Canine parvovirus [J]. Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice, 2010, 40(6): 1041-1053.

[3] 梁士哲, 魏喜仁, 范文光, 等. 狗傳染性腸炎的研究[J]. 實驗動物與比較醫學, 1982, 4: 17-20.

[4] 孫梅, 吳建華, 白文軍. 犬細小病毒研究進展[J]. 北京農業, 2013, 36: 29-31.

[5] Parrish C R, Have P, Foreyt W J,etal. The global spread and replacement of canine parvovirus strains [J]. J General Virology, 1988, 69 (5): 1111-1116.

[6] Desario C, Decaro N M, Cavalli A,etal. Canine parvovirus infection: which diagnostic test for virus?[J]. Journal of Viro-logical Methods, 2005, 126(1/2): 179-185.

[7] Decaro N, Desario C, Parisi A,etal. Genetic analysis of canine parvovirus type 2c [J]. Virology, 2009, 385(1): 5-10.[8] 張仁舟, 楊松濤, 馮昊, 等. 中國國內首次檢測到犬細小病毒CPV-2c[J]. 中國病原生物學雜志, 2010,(4): 246-249.

[9] 李廷軍. 犬細小病毒病的病理學觀察[J]. 動物醫學進展, 2009, 30(8): 125-128.

[10]Nicola D, Costantina D, Diane D A,etal. Molecular Epide-miology of Canine Parvovirus, Europe[J]. Emerging Infectious Diseases, 2007, 13(8): 1222-1224.

[11]Calderon M G, Mattion N, Bucafusco D,etal. Molecular characterization of canine parvovirus strains in Argentina: detection of the pathogenic variant CPV2c in vaccinated dogs[J]. Journal of Virological Methods, 2009, 159(2): 141-145.[12]Prittie J. Canine parvoviral enteritis: a review of diagnosis, management, and prevention[J]. Journal of Veterinary Emergency & Critical Care, 2004, 14(3): 167-176.

[13]Chinchkar S R, Subramanian B M, Rao N H,etal. Analysis of VP2 gene sequences of canine parvovirus isolates in India[J]. Archives of Virology, 2006, 151(9): 1881-1887.[14]Senda M, Parrish C R, Harasawa R,etal. Detection by PCR of wild-type canine parvovirus which contaminates dog vaccines[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1995, 33(1): 110-113.

[15]丁軻, 余祖華, 彭春平, 等. 2011-2013年河南省犬細小病毒分子流行病學調查與分析[J]. 畜牧獸醫學報, 2014, 45(10): 1671-1678.

(編輯：李文平)

Isolation and VP2 Gene Sequence Analysis of Epidemic Canine Parvovirus Strain in Jilin Province

ZHANG Shuang1，YI Shu-shuai1，WANG Yi-ming1，GUO Meng-ru1，LI Xiang2，HU Gui-xue1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun, 130118,China; 2.SongyuanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Songyuan,Changchun,138000,China)

To investigate current prevalence and viariation of canine parvovirus (CPV) among dogs in pet clinics in Jilin province, 73 anal swabs of dogs in treatment were collected from Changchun, Jilin, Liaoyuan, Songyuan and Jiutai area, Jilin province. After detection by using colloid gold fast examination reagent kit, 6 representative samples from 15 positive samples were added to F81 cell culture, and all 6 isolates(tentatively named JL-CC1, JL-CC2, JL-JL, JL-SY, JL-JT, JL-LY) were successfully isolated and identified as CPV by universal primers. VP2 gene sequence analysis showed that the nucleotide sequence homology among 6 CPV isolates was 99.3%～100%, 98.9%～99.9% compared to current domestic isolates and 98.3%～99.7% compared to abroad isolates. Phylogenetic analysis indicated that the 6 isolates belonged to 4 branches: JL-CC1, JL-LY and JL-SY isolates in same branch with Shangdong and Liaoning isolates; JL-CC2 with Heilongjiang isolate; JL-JT with Jilin isolate; JL-JL with Jilin and Heilongjiang isolates (2013). Amino acid sequence alignment showed that the 5 CPV isolates JL-CC1、JL-CC2、JL-JT、JL-LY、JL-SY belonged to New CPV-2a gene subtype, while JL-JL belonged to New CPV-2b gene subtype. Besides, there were mutations appeared at the 267th, 324th, 377th and 440th amino acid. The above results indicate that CPV, accompanying with gene variation, is mainly CPV-2a gene subtype, and CPV-2b gene subtype is a supplement in Jilin province, which will provide data support for effective prevention and control of CPV in Jilin province.

Jilin province; canine parvovirus; isolation; VP2 gene

國家重點研究計劃(2016YDF0501002)

張雙，碩士研究生，從事動物病毒學研究。

胡桂學。E-mail: huguixue901103@163.com

2016-10-01

A

1002-1280 (2017) 03-0015-06

S852.4