凝膠滲透色譜—固相萃取結(jié)合色譜—質(zhì)譜法測定乳制品中18種溴系阻燃劑

李健 王翼飛??周顯青 施致雄

摘要 采用索氏提取、凝膠滲透色譜和固相萃取技術(shù)作為前處理方法，建立乳制品中6種新型溴系阻燃劑、8種多溴聯(lián)苯醚、四溴雙酚A和α、β、γ六溴環(huán)十二烷異構(gòu)體共18種溴系阻燃劑的同時提取與凈化方法，并結(jié)合氣相色譜負化學(xué)源質(zhì)譜法（GCNCI/MS）和高效液相色譜電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCESIMS/MS）進行檢測。奶樣經(jīng)冷凍干燥后以正己烷丙酮（1KG-3∶KG-51，V/V）索氏提取，采用凝膠滲透色譜結(jié)合酸化硅膠柱凈化，隨后以LCSi固相萃取柱分離氣相和液相待測物。以GCNCI/MS測定6種新型溴系阻燃劑和8種多溴聯(lián)苯醚，以HPLCMS/MS檢測四溴雙酚A和六溴環(huán)十二烷異構(gòu)體，內(nèi)標法定量。結(jié)果表明，以空白牛奶樣品為加標基質(zhì)，多數(shù)待測物平均回收率為80.1%～114.7%，方法具有良好的精密度（多數(shù)待測物相對標準偏差（RSD）在0.87%～14.9%）和靈敏度（檢出限在0.2～119.2pg/g之間），可滿足乳制品中多種溴系阻燃劑同時提取、凈化和檢測需求。

關(guān)鍵詞溴系阻燃劑；氣相色譜負化學(xué)源質(zhì)譜；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；乳制品；固相萃取

1引言

自20世紀70年代以來，溴系阻燃劑（BFRs）被廣泛應(yīng)用于各類產(chǎn)品中，但其在生產(chǎn)、使用和產(chǎn)品廢棄過程中不斷釋放到周圍環(huán)境中，并通過食物鏈富集放大，由此帶來的環(huán)境污染和人群健康危害已成為熱點問題[1，2＼]。多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）、四溴雙酚A（TBBPA）和六溴環(huán)十二烷（HBCD）是當前產(chǎn)量最大及使用時間最長的3種溴系阻燃劑。在2009年《關(guān)于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》締約方大會已明確將多溴聯(lián)苯醚中的五溴和八溴聯(lián)苯醚列為持久性有機污染物并建議禁用。TBBPA已被歐盟列入優(yōu)先控制化學(xué)品名單，我國則由于TBBPA產(chǎn)量和消費量巨大，已成為TBBPA污染最嚴重的國家[3＼]。HBCD于2013年被確定為持久性有機污染物，我國目前也是HBCD的主要生產(chǎn)和使用國[4＼]。

隨著傳統(tǒng)阻燃劑陸續(xù)禁限用，新型溴系阻燃劑（NovelBFRs，NBFRs）逐步推廣。例如十溴二苯乙烷（DBDPE）作為十溴二苯醚替代品，自2005年在我國投產(chǎn)以來，年均增幅達80%[5＼]。其它NBFRs（如五溴甲苯（PBT））也逐漸推廣。在大氣、河流底泥、生物體等多基質(zhì)中均已發(fā)現(xiàn)NBFRs殘留[6＼]，甚至在青藏高原和極地地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了BTBPE等NBFRs，表明部分NBFRs也具有持久性有機污染物的特征[7＼]。

乳制品是當前消費量快速增長的一大類食品，尤其是嬰幼兒配方乳消費量巨大，因此乳制品中環(huán)境污染物的污染水平需持續(xù)監(jiān)控。現(xiàn)有研究多針對PBDEs和HBCD等傳統(tǒng)BFRs，極少涉及乳制品中NBFRs的監(jiān)測[8＼]。本研究采用凝膠滲透色譜結(jié)合固相萃取技術(shù)建立乳制品中多種BFRs的同時前處理技術(shù)，并采用色譜質(zhì)譜技術(shù)建立儀器分析方法，本方法穩(wěn)定可靠，適用于乳制品中BFRs的多殘留檢測，也可用于母乳或其它富含脂肪的食品樣本的檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Agilent7890B5977A氣相色譜質(zhì)譜儀、Agilent12006410高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；AccuPrepMPS全自動凝膠滲透凈化系統(tǒng)（美國J2Scientific公司）。

農(nóng)殘級或色譜級正己烷、甲醇、二氯甲烷、丙酮、環(huán)己烷、乙酸乙酯（美國J&T.Baker公司或迪馬公司）；硅膠（德國默克公司），使用前經(jīng)500℃烘烤5h后加入98%濃H2SO4制成44%酸化硅膠；優(yōu)級純濃H2SO4（98%）、無水Na2SO4（北京化工廠）。LCSi固相萃取柱（500mg，3mL，美國Supelco公司）。PBDEs混合標準樣品（BDECM）包括美國環(huán)境保護署1614草案中列出的環(huán)境中優(yōu)先關(guān)注的8種PBDEs單體：BDE28，47，99，100，153，154，183和209；新型溴系阻燃劑單體，五溴甲苯（PBT）、五溴乙苯（PBEB）、六溴苯（HBB）、2，3二溴丙基2，4，6三溴苯基醚（DPTE）、1，2雙（2，4，6三溴苯氧基）乙烷（BTBPE）和十溴二苯乙烷（DBDPE）；內(nèi)標：3，3′，4，4′，四溴聯(lián)苯醚（BDE77）和2，2′，3，3′，4，4′，六溴聯(lián)苯醚（BDE128），上述標準品均購于美國AccuStandard公司。αHBCD，βHBCD，γHBCD和TBBPA及同位素內(nèi)標13C12BDE209，13C12αHBCD，13C12βHBCD，13C12γHBCD和13C12TBBPA均購自美國WellingtonLaboratories公司。

2.2樣品處理

提取：純牛奶、酸奶、奶粉等奶制品或母乳樣品，根據(jù)脂肪含量取3～15g（確保脂肪含量約1g），經(jīng)冷凍干燥機凍干后，于研缽中研碎后置于纖維素提取套筒中，加入內(nèi)標BDE77、BDE128各1ng，13C12BDE209、13C12TBBPA與13C12α，β，γHBCD各10ng，加標實驗時需再加入不同濃度的待測物混合標準液，隨后以正己烷/丙酮（1KG-3∶KG-51，V/V）索氏提取16h以上。

自動凝膠色譜凈化：索氏提取后蒸去溶劑，以重量法計算脂肪含量，加入乙酸乙酯/環(huán)己烷（1KG-3∶KG-51，V/V）復(fù)溶至6mL。自動凝膠凈化系統(tǒng)采用低壓填充柱，填料為50gBioBeadsSX3，柱規(guī)格50cm×2cmi.d.；紫外檢測器檢測波長240nm；流動相為乙酸乙酯/環(huán)己烷（1KG-3∶KG-51，V/V），流速5mL/min，進樣量5mL，收集20～45min流出組分并減壓蒸發(fā)至近干，加2mL正己烷復(fù)溶，待下一步凈化。

酸化硅膠凈化：采用自制酸化硅膠凈化柱，于20cm×1cm玻璃柱中自下而上依次裝填1cm高無水Na2SO4，5g酸化硅膠，1cm高無水Na2SO4。酸化硅膠柱經(jīng)10mL正己烷淋洗后上樣，先用30mL正己烷，再用10mL二氯甲烷洗脫待測物，洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加2mL正己烷復(fù)溶，待固相萃取柱分離。

氣相與液相待測物分離：采用LCSiSPE柱分離氣相與液相待測物。SPE柱經(jīng)6mL正己烷活化后上樣，先用6mL正己烷洗脫PBDEs和NBFRs，再用6mL丙酮洗脫TBBPA和HBCD。正己烷洗脫液經(jīng)氮氣吹干后，加入100μL正己烷復(fù)溶，待GCNCI/MS檢測；丙酮洗脫液經(jīng)氮氣吹干后，加入200μL甲醇復(fù)溶，待HPLCMS/MS檢測。

2.3色譜質(zhì)譜條件

2.3.1GCNCI/MS分析條件

GC分析條件：用于檢測三至七溴聯(lián)苯醚（TriHeptaBDE）及PBT，PBEB，HBB，DPTE和BTBPE的色譜柱為30mDB5MS毛細管柱（30m×0.25mm，0.25μm，美國安捷倫公司），色譜柱升溫程序：100℃（保持1.5min），以20℃/min升溫至240℃，以5℃/min升溫至270℃，以15℃/min升溫至300℃（保持7min）；載氣流速在初始至17min為1.5mL/min，之后升至3mL/min。用于檢測BDE209和DBDPE的色譜柱為15mDB5MS毛細管柱（15m×0.25mm，0.1μm，美國安捷倫公司），色譜柱升溫程序：100℃（保持1.5min），以25℃/min升溫至200℃，以15℃/min升溫至300℃，保持6min，柱流量為1.5mL/min。其余條件均相同：載氣為He（純度>99.995%）；不分流進樣，進樣量1μL；進樣口溫度270℃；傳輸線溫度300℃。

NCI/MS分析條件：甲烷反應(yīng)氣壓力0.2MPa；離子源溫度200℃，溶劑延遲時間5min。掃描方式為選擇離子監(jiān)測（SIM），BDE209定量離子為m/z486，定性離子為m/z488，13C12BDE209定量離子為m/z494，定性離子為m/z492，其它待測物檢測離子均為m/z79和81。以BDE77作為三至六溴聯(lián)苯醚以及PBT，PBEB，HBB和DPTE的內(nèi)標，BDE128作為BDE183和BTBPE的內(nèi)標，13C12BDE209作為BDE209和DBDPE的內(nèi)標。

2.3.2HPLCMS/MS分析條件HPLC條件色譜柱為EclipsePlusC18柱（100mm×2.1mm，3.5μm，美國安捷倫公司）；柱溫40℃；進樣體積20μL；流速0.3mL/min。流動相A為甲醇，流動相B為水，梯度洗脫：0～0.5min，40%A；0.6～5.0min，40%～80%A；5.1～9.0min，80%～85%A；9.1～13.0min，85%～100%A；13.1～15.0min，100%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，負電離模式＼[ESI（-）＼]；毛細管電壓3.5kV；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣為N2，流量10L/min；檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；監(jiān)測離子對為（括號中為碰撞能量）：TBBPAm/z542.6/80.9及542.6/78.9（60eV），13C12TBBPAm/z554.6/80.9及554.6/78.9（60eV），HBCDm/z640.7/78.9及640.7/80.9（10eV），13C12HBCDm/z652.7/78.9及652.7/80.9（10eV）。

3結(jié)果與討論

3.1樣品前處理條件優(yōu)化

生物基質(zhì)中BFRs的提取多采用混合溶劑液固萃取法，如索氏提取或加速溶劑萃取，該方法操作簡單且萃取效率較高[9＼]。樣本提取后的凈化操作中需盡可能去除共萃取出來的油脂成分以避免雜質(zhì)干擾測定。因在凝膠色譜上待測物流出時間為20～45min，脂肪類雜質(zhì)流出時間為10～25min。因此本實驗中先采用凝膠滲透色譜法去除大部分脂肪，再采用酸化硅膠去除剩余脂肪。

由于HBCD的3種異構(gòu)體在高溫下易互相轉(zhuǎn)化，TBBPA因含有酚羥基采用氣相測定需衍生化，因此測定HBCDs和TBBPA的最佳方法為HPLCMS/MS，然而GCNCI/MS是測定PBDEs和本實驗所檢測的幾種NBFRs的首選方法。因此前處理過程中若能有效分離HBCD/TBBPA與PBDEs/NBFRs，各待測物便均可在最佳條件下進行檢測。本研究表明，在LCSiSPE柱上可實現(xiàn)兩部分待測物的分離，以正己烷為溶劑時，PBDEs和NBFRs在LCSi柱中不被保留，隨正己烷流出，HBCD/TBBPA則被LCSi填料吸附，并可在PBDEs和NBFRs完全流出后再應(yīng)用強極性溶劑洗脫。分離操作時，上樣后再加6mL正己烷，即可完全洗脫PBDEs和NBFRs。隨后采用強極性溶劑丙酮可完全洗脫HBCD/TBBPA。

3.2色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化

PBDEs測定常采用15m或30m毛細管柱。本研究表明，BDE28和PBT在15m柱上共流出（圖1b），在30m柱上兩者可以獲得良好分離，但在30m柱上高溴代的BDE209和DBDPE由于保留時間過長，導(dǎo)致高溫分解無法出峰，因此采用30m柱檢測除BDE209及DBDPE外其余化合物（圖1a），采用15m柱檢測BDE209和DBDPE（圖1b）。NCI/MS是測定PBDEs最常用方法，通過對6種NBFRs測定條件的摸索發(fā)現(xiàn)待測NBFRs與PBDEs類似，在NCI/MS下響應(yīng)明顯高于EI/MS，且在NCI源中產(chǎn)生的最主要離子同樣是Br

，該結(jié)果與現(xiàn)有文獻結(jié)果相同[10，11＼]。TBBPA和HBCD的質(zhì)譜優(yōu)化結(jié)果與現(xiàn)有文獻結(jié)果類似，均在ESI源的負離子模式下呈現(xiàn)出最高響應(yīng)[12＼]。

3.3方法學(xué)考察

3.3.1線性實驗與檢出限用正己烷配制PBDEs和NBFRs系列混合標準溶液，其中三溴至七溴聯(lián)苯醚以及PBT，PBEB，HBB，DPTE和BTBPE的濃度為1～100pg/μL，BDE209和DBDPE的濃度為10～1000pg/μL。內(nèi)標BDE77和BDE128濃度均為10pg/μL，13C12BDE209濃度為100pg/μL。用甲醇配制HBCD和TBBPA系列混合標準溶液，濃度5～500pg/μL，內(nèi)標13C12α，β，γHBCD和13C12TBBPA濃度均為50pg/μL。按照2.3節(jié)所述方法采集各標準溶液色譜圖，以各待測物與相應(yīng)內(nèi)標物峰面積的比值為縱坐標，各待測物與內(nèi)標物含量的比值為橫坐標，繪制標準曲線，得到的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

方法的檢測限（LOD）實驗以牛奶為加標基質(zhì)，測定最低加標水平的響應(yīng)，計算信噪比（S/N），以S/N=3和S/N=10時對應(yīng)的濃度為檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。各化合物的保留時間、線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、LOD和LOQ結(jié)果見表1。各待測物的標準曲線的相關(guān)系數(shù)R2為0.9989～0.9998，表明標準曲線線性良好。

3.3.2加標回收實驗以經(jīng)檢測無待測物殘留的某品牌純牛奶為空白基質(zhì)進行加標回收實驗，取樣量10g，加標水平如表2所示，每個加標水平按本方法平行測定5次，加標回收率及RSD列于表2。BTBPE回收率普遍偏低且RSD值較高，說明BTBPE在前處理過程中不穩(wěn)定且有較高損失，其余待測物平均回收率在80.1%～114.7%之間，RSD在0.87%～14.9%之間。

3.3.3基質(zhì)效應(yīng)采用提取后添加法考察HPLCMS/MS分析中的基質(zhì)效應(yīng)，即比較兩組溶液的待測物信號峰面積，其中組1為標準品溶液，組2為某空白純牛奶樣提取液中添加標準品所得溶液，則基質(zhì)效應(yīng)（ME）=基質(zhì)溶液中待測物峰面積/純?nèi)軇┲写郎y物峰面積。通過對0.1，1.0和10ng/g3個濃度水平的測定，發(fā)現(xiàn)乳制品測定時存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，HBCD和的基質(zhì)效應(yīng)比TBBPA更加明顯。TBBPA的ME在0.84～0.95之間，αHBCD的ME為0.71～0.93，βHBCD和γHBCD的ME比較接近，均在0.6～0.8之間。為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，除了對樣品前處理方法和檢測條件進行優(yōu)化之外，采用穩(wěn)定性核素標記物（13C12HBCD和13C12TBBPA）作為內(nèi)標是必不可少的。

3.4實際樣品測定

應(yīng)用所建立方法檢測8份市售奶制品樣本以ZH（及從某婦幼保健院采集的2份母乳樣本，結(jié)果見表3。在PBDEs、TBBPA和HBCD3種傳統(tǒng)阻燃劑中，BDE28，47和99檢出率較高，但BDE209污染水平較高，TBBPA和HBCD在母乳中的污染水平比乳制品要高，因為BFRs多具有生物蓄積性，因此處在食物鏈高端的人類體內(nèi)BFRs含量普遍高于處在食物鏈低端的食草類動物。HBCD的3個異構(gòu)體中，由于代謝速度差異和體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致βHBCD和γHBCD在生物體內(nèi)含量普遍低于αHBCD，本研究中αHBCD檢出率較高而βHBCD和γHBCD均未檢出，與文獻＼[13＼]結(jié)果類似。在NBFRs中，DBDPE可能由于檢出限較高的關(guān)系均未檢出。PBT在所有樣本中均可檢出，HBB，DBTE和BTBPE檢出率也較高，說明隨著NBFRs的迅速推廣應(yīng)用，食品中NBFRs的污染水平也可能隨之升高，需持續(xù)關(guān)注。ZH）

3.5小結(jié)

以索氏提取、凝膠色譜和固相萃取為前處理方法，GCNCI/MS和HPLCMS/MS為儀器分析方法，建立了乳制品中18種溴系阻燃劑的檢測方法，并實現(xiàn)了18種溴系阻燃劑的同時提取與凈化。本方法穩(wěn)定可靠，可用于食品及生物樣品中溴系阻燃劑的多殘留分析。

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AbstractAnovelmethodwasdevelopedforthesimultaneousdeterminationof6novelbrominatedflameretardants（NBFRs），8polybrominateddiphenylethers（PBDEs），tetrabromobisphenolA（TBBPA）andα，β，γhexabromocyclododecane（α，β，γHBCD）indairyproduct.Dairyproductsampleswereextractedusingsoxhletextractionwithacetone/hexane（1KG-3∶KG-51，V/V）.Theremovalofcoextractedmaterialswasachievedbygelpermeationchromatographyfollowedbyacidifiedsilicatreatment.ThefractionationofthePBDEs/NBFRsandHBCD/TBBPAwasperformedusingaSupelcoLCSiSPEcartridge.ThedetectionofthePBDEsandNBFRswasthenperformedbyGCNCI/MS，andthatoftheHBCDsandtheTBBPAwasperformedusingHPLCMS/MS.Arecoverytestwasperformedusingamatrixspikingtestandformostoftheanalytestherecoveriesrangedfrom80.1%to114.7%withRSDsequaltoorlowerthan14.9%.TheLODswere0.2-119.2pg/g.Thismethodologywasvalidatedtobeaccurateandsensitiveforthesimultaneouspretreatmentandanalysisofbrominatedflameretardantsindairyproduct.

KeywordsBrominatedflameretardants；Gaschromatographynegativechemicalionizationmassspectrometry；Highperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry；Dairyproduct；Solidphaseextraction

HQWT6JY（Received30March2016；accepted23June2016）