超高效液相色譜—三重四極桿質譜法測定大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類及氨基酸類神經化學物質

黃鑫 李帥坪 張勇 劉淑瑩

摘要 建立了超高效液相色譜三重四極桿質譜法檢測大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類及氨基酸類神經化學物質含量的方法。選用Hypercarb（100mm×2.1mm，5μm）色譜柱，以0.1%甲酸甲醇為流動相，梯度洗脫。電噴霧離子源（ESI）在正離子模式下，選擇多反應監測模式（MRM）掃描，對檢測的6種生物胺類和11種氨基酸類神經化學物質分別選擇一個定性離子對和一個定量離子對。測定Wistar大鼠海馬和大腦皮層中6種生物胺類和11種氨基酸類神經化學物質的含量，對比兩種不同腦組織樣品前處理方法對神經化學物質含量測定結果的影響。17種神經化學物質在10min內即可完成同時測定，檢測方法線性關系良好，日內和日間精密度、加標回收率和重復性滿足分析要求。本方法準確、靈敏度高、專屬性強、重復性好，適用于腦組織中生物胺類及氨基酸類神經化學物質的含量測定，可為生物胺類及氨基酸類神經化學物質提供有效的樣品前處理方法和檢測手段。

關鍵詞超高效液相色譜三重四極桿質譜法；生物胺類神經化學物質；氨基酸類神經化學物質；腦組織

1引言

神經遞質（Neurotransmitter）在神經化學傳遞中是充當“信使”的特定化學物質。腦內神經遞質分為4類，即生物胺類、氨基酸類、肽類和其它類。隨著神經生物學的發展，陸續在神經系統中發現了大量具有神經活性的物質。生物胺類遞質是最先發現的一類神經遞質，包括多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（E）、5羥色胺（5HT）。酪氨酸（Tyr）是DA、NE和E的前體，色氨酸（Try）是5HT的前體，在多種應激情況下，維持正常的生物胺類遞質代謝和腦功能的發揮。5羥吲哚乙酸（5HIAA）是5HT代謝的產物，5HIAA的變化也可間接反應5HT的變化。褪黑激素（Melatonin）主要是由哺乳動物和人類的松果體產生的一種胺類激素，5HT在N乙?；D移酶的作用下，轉化成N乙酰基5羥色胺，最后合成Melatonin。生物胺類神經化學物質在人體和哺乳動物的中樞神經、心血管和內分泌等組織系統中發揮著廣泛的調節作用，參與情緒、情感、應激行為和睡眠覺醒等多種生理過程[1＼]，含量的變化與人類多種疾病密切相關，是診斷阿爾茨海默癥、唐氏綜合征、抑郁癥和帕金森等疾病的重要依據[2～5＼]。組胺（Histamine）是一種活性胺化合物，作為身體內的一種化學傳導物質，可以影響許多細胞的反應，中樞組胺能神經系統影響腦部神經傳導，參與睡眠、荷爾蒙的分泌、體溫調節、食欲與記憶形成等功能[6＼]。乙酰膽堿（Ach）是中樞膽堿能系統中重要的神經遞質之一，其主要功能是維持意識的清醒，在學習記憶中起重要作用。被確定為神經遞質的氨基酸有γ氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、?；撬幔═au）和絲氨酸（Ser）[7＼]。谷氨酰胺（Gln）作為大腦的一種能量來源，具有保護大腦的功能，能改善心情、增強智力，并有益于長期與短期記憶[8，9＼]。氨基酸類神經化學物質對于調節機體生理活動具有重要作用，其含量及比例的變化與多種中樞神經系統疾病的發生及發展密切相關[2～5，10＼]。因此，生物樣品中生物胺類及氨基酸類神經化學物質的準確測定對于某些疾病的篩查、診斷和治療以及藥物在體內的作用具有重要意義。

神經化學物質在生物樣品中的含量很低，而生物樣品本身基體復雜，內源性干擾物質較多，因此高效快速的樣品前處理方法和高靈敏度的檢測手段是開展神經化學物質研究的難點。采用高效液相色譜分離，再以紫外、熒光、電化學和質譜方法檢測，是測定神經化學物質較常用的方法[11～21＼]。由于氨基酸無紫外吸收，用液相色譜法進行檢測時需對氨基酸進行柱前或柱后衍生[16～20＼]。生物胺類神經化學物質為強極性化合物，在反相色譜柱上保留極弱，對熒光和質譜的響應信號較弱，可通過衍生化處理改善色譜保留行為和離子化效率[16～19，21＼]。但衍生操作步驟繁瑣，耗時耗力，而且衍生程度也難以保證，JP衍生反應還可能生成非目標衍生物，這些對神經化學物質的準確測定都會產生影響。目前，HPLCMS/MS兼具分離能力強和靈敏度高的優勢，已逐漸發展成為復雜生物體系中痕量生物活性物質分析的強有力手段[22～26＼]。

本研究采用超高效液相色譜三重四極桿質譜法建立了對大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類及氨基酸類共17種神經化學物質同時快速分析的方法。本方法的選擇性和重現性好，靈敏度高，并且無需對樣品進行衍生化和固相萃取等復雜的前處理，簡化了分析步驟，提高了分析效率。對比了兩種不同腦組織樣品前處理方法對神經化學物質含量測定結果的影響。本方法可應用于腦組織中生物胺類及氨基酸類神經化學物質的分析測定，為臨床檢測提供了有效的樣品前處理方法和檢測手段。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

DionexUltimate3000超高效液相色譜儀TSQEndura三重四極桿質譜儀，Hypercarb色譜柱（100mm×2.1mm，5μm）（ThermoScientific公司）；電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；BioGenPRO200型精密勻漿器（PROScientific公司）；EppendorfAG22331Hamburg離心機（GermanyEppendorf公司）。

多巴胺（DA）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）、5羥色胺（5HT）、5羥吲哚乙酸（5HIAA）、褪黑激素（Melatonin）、γ氨基丁酸（GABA）、酪氨酸（Tyr）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、天冬氨酸（Asp）、?；撬幔═au）、絲氨酸（Ser）、色氨酸（Try）、乙酰膽堿（ACh）、組胺（Histamine）對照品均購于Sigma公司；甲醇和甲酸（色譜純，Fisher公司）；實驗用水為MilliQ超純水。

Wistar大鼠20只（雄性，體重180～200g），適應性喂養1周后，隨機分為2組。

2.2實驗方法

2.2.1色譜條件流動相A：0.1%甲酸；流動相B：甲醇；流速：0.2mL/min；柱溫：25℃；進樣量：2μL；梯度洗脫：0～3min，0%B；3～10min，0%～100%B；10～12min，100%～0%B。10～12min流出物切換至廢液，不進入質譜檢測。

2.2.2質譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式，多反應檢測（MRM），毛細管電壓為3.0kV，離子傳輸管溫度為300℃；霧化器溫度為300℃；鞘氣流速35arb；輔助氣流速5arb。質譜采集參數如表1所示。

2.2.3對照品溶液的配制分別準確稱取DA，E，NE，5HT，5HIAA，Melatonin，GABA，Tyr，Gly，Glu，Gln，Asp，Tau，Ser，Try，ACh、Histamine對照品各5mg，以0.1%甲酸溶解，分別定容至5mL，配成濃度為1mg/mL溶液。

2.2.4供試樣品的處理腦組織樣品前處理方法A：取大鼠斷頭處死，冰臺上立即取腦，放于冰冷的生理鹽水中漂洗，濾紙吸干生理鹽水，將腦置于冰臺上迅速剝離海馬體與大腦皮層，稱重。冰冷的0.1%甲酸加入到腦組織中，按1KG-3∶KG-510（V/W）勻漿。4℃下，12000r/min離心20min，取上清液，經0.22μm微孔濾膜過濾，待測。

腦組織樣品前處理方法B[26＼]：取大鼠斷頭處死，立即取腦，置于80℃水浴2min后取出，用濾紙吸干水，迅速剝離海馬體與大腦皮層，稱重。冰冷的0.3%甲酸乙腈加入到腦組織中，按1KG-3∶KG-510（V/W）勻漿。4℃下，12000r/min離心20min，取上清液，經0.22μm微孔濾膜過濾，待測。

3結果與討論

3.1色譜、質譜條件優化

分別取DA，E，NE，5HT，5HIAA，Melatonin，GABA，Tyr，Gly，Glu，Gln，Asp，Tau，Ser，Try，ACh，Histamine對照品的1mg/mL溶液，以0.1%甲酸溶液稀釋至5μg/mL。采用直接進樣方式，電噴霧離子源（ESI），優化各神經化學物質三重四極桿質譜分析條件，分別嘗試正、負離子模式；毛細管電壓為2.0～5.0kV；離子傳輸管溫度為200～400℃；霧化器溫度為200～400℃；鞘氣流速20～50arb；輔助氣流速0～10arb。并自動優化各神經化學物質在多反應檢測（MRM）時所產生的碎片離子種類和豐度以及所需碰撞能量。

色譜條件優化，考慮到所分析神經化學物質的極性較強、水溶性較好和在色譜柱上的保留問題，嘗試了不同類型的色譜柱（C8、C18和Hypercarb），Hypercarb色譜柱以多孔石墨化碳為固定相，對強極性化合物的保留和分離效果更好，且在不同梯度洗脫時，在100%水相條件下，保持穩定的保留和分離；考慮神經化學物質的離子化效率較低的問題，比較了純水和不同濃度甲酸溶液作為流動相對分離、分析效果的影響，結果表明，0.1%甲酸為流動相時分析效果更佳。最終建立了無需衍生化、對腦組織樣品中17種神經化學物質同時定量分析的UPLCMS/MS方法。

3.2方法學考察

3.2.1標準曲線及定量限采用外標法定量，各取適量按照上述方法配制的對照品溶液混合，再根據需要用0.1%甲酸溶液逐級稀釋成不同濃度的系列混合對照溶液。以待測物濃度作為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標，得到17種待測神經化學物質的線性回歸方程。以信噪比（S/N）>10確定方法的定量限（LOQ）。各神經化學物質的線性范圍、相關系數及定量限結果列于表2。

3.2.2精密度配制高、中、低3個濃度水平的混合對照品溶液，平行測定6次，計算各神經化學物質峰面積的RSD，測得日內精密度（Intradayprecision）。連續測定3日，計算各神經化學物質峰面積的RSD，測得日間精密度（Interdayprecision）。測定結果如表2所示。LM

3.2.3加標回收率

取同一腦組織樣品勻漿液，分別加入高、中、低3個濃度水平的混合對照品溶液，按照2.2.4節中樣品處理方法A操作，平行測定6次，計算各神經化學物質的加標回收率（Recovery），結果如表2所示。

3.2.4重復性取同一腦組織樣品勻漿液6份，按照2.2.4小節中樣品處理方法A操作，平行測定6次，計算各神經遞化學物質峰面積的RSD，測得重復性（Repeatability），結果如表2所示。

3.3腦組織樣品前處理方法比較結果

大鼠大腦皮層中17種神經化學物質經UPLCMS/MS分析所得的提取離子流圖如圖1所示。不同前處理方法下大鼠海馬和大腦皮層中17種神經化學物質的含量水平結果如表3所示。所測4組樣品均檢測到待測的17種神經化學物質，經方法A處理的海馬和大腦皮層中5HT、Melatonin、GABA、Gln、Glu、Ser、Gly、Asp、Tyr和Try的測得含量顯著高于經方法B處理的海馬和大腦皮層中的測得含量；DA、E、NE、5HIAA、ACh、Histamine和Tau的測得含量在經方法A處理的海馬和大腦皮層中略高于經方法B處理的海馬和大腦皮層。綜上所述，腦組織樣品前處理方法A優于方法B。

4結論

本實驗建立了UPLCMS/MS法對大鼠海馬與大腦皮層中生物胺類及氨基酸類17種神經化學物質同時快速檢測的方法。利用超高效液相色譜三重四極桿質譜聯用技術的優勢，分別優化液相色譜和質譜條件，選擇合適的電離模式，對質譜參數進行了優化，對檢測的6種生物胺類和11種氨基酸類神經化學物質分別選擇一對定性離子對和定量離子對，最終實現對17種神經化學物質的分離、提取及確證，實現了它們的定量分析。此方法可在10min內完成17種神經化學物質同時分析，檢測時間短、線性關系較好、方法回收率高、穩定性良好，滿足分析要求。本實驗對大鼠海馬和大腦皮層前處理方式進行探究，對比了兩種樣品前處理方法，實驗結果表明，冷環境處理方式下測得大鼠海馬與大腦皮層中神經化學物質含量較高，此方法無需衍生化、操作簡單、可直接測定。

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AbstractAnultraperformanceliquidchromatographytandemmass（UPLCMS/MS）spectrometrymethodwasestablishedfordeterminationofthecontentsofbioamineandaminoacidneurochemicalsinhippocampusandcerebralcortexofrat.Hypercarbcolumn（100mm×2.1mm，5μm）wasusedforthesampleseparationwith0.1%formicacidmethanolasthemobilephaseundergradientelution.TheneurochemicalsweredetectedbyMS/MSusingESIionsourceunderpositiveionizationmodewithMRMscan.Bothquantificationandconfirmationionswerechosenforeach6bioamineand11aminoacidneurochemicals.Theinfluenceoftwodifferentprocessingmethodsonthecontentsofneurochemicalsinbraintissueswascompared.Total17neurochemicalsweresimultaneouslydetectedin10min.Thecalibrationcurvewaswithagoodlinearrelationship.Theintradayandinterdayprecision，averagerecoveryandrepeatabilitycouldmeettheanalysisrequirement.ThisUPLCMS/MSmethodshowsexcellentselectivity，accuracy，highsensitivity，specificityandgoodrepeatability，andissuitablefortheseparationandquantizationofbioamineandaminoacidneurochemicalsinbraintissue.

KeywordsUltraperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry；Bioamineneurochemicals；Aminoacidsneurochemicals；Braintissue

HQWT6JY（Received27April2016；accepted8June2016）