質譜快速分析豬肉中痕量沙丁胺醇及克倫特羅

肖義坡 盧海艷 呂邵軍 謝少賢 王兆征 陳煥文

摘要采用內部萃取電噴霧電離質譜（iEESIMS）技術，在無需樣品預處理的前提下，采用標準加入法直接對豬肉組織中沙丁胺醇與克倫特羅進行定性和定量分析。結果表明，本實驗對豬肉組織中沙丁胺醇與克倫特羅具有較高的靈敏度，單個樣品單一指標的檢測時間少于30s。在0.01～1000μg/kg濃度范圍內，信號強度對數（Y）與濃度對數（X）具有較好的線性關系，定量限分別為6.2和9.8ng/kg。本方法分析速度快、樣本耗量少、靈敏度高，適用于豬肉中痕量沙丁胺醇與克倫特羅等“瘦肉精”的快速檢測。

關鍵詞內部萃取電噴霧電離；沙丁胺醇；克倫特羅；“瘦肉精”；組織分析

1引言

“瘦肉精”是指一類具有相似結構的β激動劑化合物，常見的主要有沙丁胺醇與克倫特羅，臨床上一般用于治療休克和哮喘等疾病[1＼]。由于該類藥物具有抑制動物脂肪的合成、促進瘦肉生長和重新分配家畜脂肪與瘦肉比例等作用，常被非法添加在家畜的飼料中來提高畜牧生產效率。根據農業部公告第235號，沙丁胺醇與克倫特羅為禁用物質，在食品（肉中）不得檢出。常規情況下豬肉中“瘦肉精”檢測為陽性的含量水平在0.1～100μg/kg之間。人食用含沙丁胺醇與克倫特羅等“瘦肉精”成分的肉類產品后，會導致血壓升高、心率加快等反應，甚至影響水上及部分田徑運動項目的成績，長期服用也對心血管系統帶來嚴重的危害，甚至導致生命危險[2＼]。因此，建立一種肉質食品中“瘦肉精”的快速、準確的檢測方法，對保障食品安全具有重要意義[3～6＼]。

目前，動物組織中“瘦肉精”的檢測方法主要包括膠體金免疫層析法[7，8＼]、酶聯免疫吸附法（ELSA）[9，10＼]和表面等離子體共振生物芯片[11，12＼]、氣相色譜質譜法（GCMS）[13，14＼]、高效液相色譜質譜法（HPLCMS）[15～17＼]、高效液相色譜法[18，19＼]等。膠體金免疫層析法，主要用于大量篩查，但檢測結果因受環境或者人為因素的影響而存在一定誤差，適合初步判定；酶聯免疫吸附法，雖然靈敏度較高，但存在假陽性結果，重現性與特異性較差；HPLCMS法與GCMS法操作過程繁瑣檢測效率較低，難以滿足大批量的樣品檢測要求。

內部萃取電噴霧電離質譜（iEESIMS）技術直接將萃取劑導入到組織樣品內部，可實現組織樣品內部小分子代謝產物等組分的直接質譜分析[20～23＼]。本研究基于iEESIMS技術，開發能直接判斷肉質食品內部沙丁胺醇與克倫特羅的內部萃取電噴霧電離線性離子阱質譜（iEESILTQMS）檢測平臺，建立對豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅進行準確定性及快速定量的檢測方法，并用于分析豬肉實際樣品。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

內部萃取電噴霧電離源（iEESI）為本實驗室自制；LTQXL線性離子阱質譜儀并配有Xcalibur數據處理系統（美國ThermoScientific公司）；石英毛細管（內徑0.10mm，外徑0.19mm，美國Agilent公司）；甲醇（色譜純，美國ROE公司）；實驗用水為二次蒸餾水。

標準品：克倫特羅（批號00435479）、沙丁胺醇（批號103578453245）均來自LaboratorienBerlinAdlershofGmbH公司。標準儲備液：稱取適量沙丁胺醇與克倫特羅各標準品，加蒸餾水使溶解，各制成10mg/L的標準貯備液，

18℃避光保存。標準品溶液：將標準儲備液分別配制成濃度為0.01，0.1，1，10，100和1000μg/L的標準溶液，按2.2節操作，供iEESIMS檢測使用。

豬肉樣品由江西省體育科學研究所提供，經國家標準方法檢測不含沙丁胺醇與克倫特羅等β受體激動劑。

2.2實驗方法

iEESIMS原理如圖1所示。將石英毛細管插入組織樣品內部，毛細管尖端與樣品頂端相距2mm；樣品頂端到質譜進樣口的距離為4～5mm；實驗選擇甲醇水（1KG-3∶KG-51，V/V）作為萃取劑，將萃取溶劑由毛細管直接導入到豬肉樣品內部，流速為1μL/min。

在微量進樣針的鋼針部位施加正高電壓，在電場的作用下，豬肉樣品尖端產生大量承載豬肉化學組分的微小帶電液滴（電噴霧），微小帶電液滴中的分析物去溶劑化后得到待測物離子，進行質譜檢測。質譜儀設置為正離子檢測模式，PS05351.eps，Y，PZ#TS（（1HT5”SS

（iEESIMS））TS）質量掃描范圍m/z50～400，離子源電壓為5kV，離子傳輸管溫度設置為150℃。在進行串聯質譜分析時，母離子隔離寬度為1Da，碰撞能量為16%～25%，碰撞時間為50ms；離子透鏡電壓及其它檢測參數由LTQTune系統自動優化。JP

2.3定性與定量分析

選擇采用國家標準方法[24，25＼]及iEESIMS方法均檢測不到沙丁胺醇或克倫特羅信號的豬肉為空白樣品；其次采用加標法處理樣品，將空白豬肉樣本切成體積一致的小長條（20mm×2mm×2mm，155mg）浸泡在沙丁胺醇與克倫特羅標準溶液中，浸泡10h后進行iEESIMS分析，獲得沙丁胺醇與克倫特羅的特征碎片，完成定性分析；最后采用加標濃度法結合目標離子的二級特征碎片離子信號進行定量分析，建立在0.01～1000μg/kg范圍內待測物離子特征碎片強度的對數（Y）與加標濃度的對數（X）之間的關系曲線，并采用此曲線完成定量分析。

3結果與討論

3.1豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅的定性分析

圖2為在m/z50～400質量范圍內豬肉樣品的iEESIMS一級化學指紋譜圖。在實驗條件下，沙丁胺醇（MW239）與克倫特羅（MW277）都能夠在iEESI過程中形成質子化準分子離子，分別在一級質譜中形成準分子離子峰m/z240及277。但是，豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅的含量遠小于其它豬肉中常見組分，如氨基酸、磷脂等，所以在一級質譜中（圖2），二者的信號幾乎淹沒在其它大量組分物質的信號中。因此，僅依賴一級質譜難以對豬肉中是否含有微量沙丁胺醇與克倫特羅進行判斷。

為避免假陽性結果，按照實驗條件對離子m/z240＼[Salbutamol+H＼]+和m/z277＼[Clenbuterol＼]+進行CID實驗，所獲得的MS/MS譜圖如圖3所示。在CID條件下，母離子m/z240主要碎片離子為m/z222，166和148，碎片離子m/z222是由母離子丟失一個水分子得到的，這與文獻＼[26＼]報道一致。經分析推斷，碎片離子m/z166可能是由m/z222繼續失去＼[-C（CH3）3＼]（m/z57）得到，碎片離子m/z148是由m/z166失去一個水分子得到的。同樣地，選擇質子化的m/z277進行CID實驗，主要碎片離子為m/z259和203，碎片離子m/z259由母離子丟失一個水分子后產生，該碎片離子不穩定，繼續丟失＼[-C（CH3）3＼]（m/z57）得到碎片離子m/z203，這與文獻＼[27＼]報道一致。

3.2豬肉中沙丁胺醇與克倫特羅的定量分析

3.2.1線性范圍和檢出限實驗配制10倍遞增的系列梯度濃度0.01～1000μg/L的沙丁胺醇與克倫特羅標準溶液，按上述方法進行實驗。每個濃度的標準樣品測定5次，以其凈響應信號強度平均值與對應的標準溶液濃度繪制標準對數曲線。實驗表明，在0.01～1000μg/L范圍內，二級離子信號強度的對數（Y）與加標濃度的對數（X）具有較好的線性關系。其中，沙丁胺醇線性回歸方程為Y=0.2314X+1.9076，相關系數R2=0.9940；克倫特羅線性回歸方程為Y=0.2223X+1.8940，相關系數R2=0.9938。

對浸泡在濃度為c的沙丁胺醇與克倫特羅標準品的豬肉樣本進行測定，獲得凈相應的信號強度S（n=5），并測得3倍標準偏差3σ（S/N≥3，n=5）。根據LOD=c3σ/S[28，29＼]，當c值取標準曲線的最低點時，計算本方法對兩種“瘦肉精”的檢出限。測得本方法對沙丁胺醇和克倫特羅的檢出限分別為6.2和9.8ng/kg。

3.2.2回收率和精密度在5份155mg豬肉樣品中，向1份樣品中加入10μL蒸餾水，向2份樣品中分別加入10μL濃度均為10μg/L的沙丁胺醇和克倫特羅標準溶液，向另2份樣品中分別加入10μL濃度均為100μg/L的沙丁胺醇和克倫特羅標準溶液。設定標準品溶液密度為1kg/L，將濃度單位統一轉換為μg/kg。按照本方法進行測定，每個水平重復測定10次。加標回收率為94.5%～103.0%，精密度在7.0%～9.5%之間，見表1。采用手動進樣，單個樣品測定時間少于30s，分析速度較快。實驗結果中精密度較大的原因可能是由于手動進樣時的不穩定性造成的[30，31＼]。

3.3實際樣品分析

采用本方法對豬肉樣品進行測定，每個樣品在0.5min內即獲得了檢測結果。為了獲得豬肉樣品中兩種“瘦肉精”的定量信息，單個樣品連續測定10次，分別得到二級離子的凈響應信號強度，通過工作曲線，由線性回歸方程求出“瘦肉精”含量，得到所檢測5個批次樣品中沙丁胺醇與克倫特羅的含量。并同時采用國標法（GB/T5009.1922003，動物性食品中克倫特羅殘留量的測定）對樣品進行檢測，對比兩種方法的檢測結果并計算準確度。結果表明，5批豬肉樣品中兩種瘦肉精含量10次測定結果的準確度在87.4%～107.6%之間，結果如表2所示。

實驗結果表明，本方法分析速度快、樣品耗量少、靈敏度高，在大批量肉質食品中“瘦肉精”的快速檢測方面具有較好的應用前景。

4結論

本研究建立了iEESIMS串聯質譜直接檢測豬肉中痕量沙丁胺醇與克倫特羅含量的快速質譜檢測方法，快速準確地進行豬肉中“瘦肉精”的定性與定量分析。本方法單個樣品檢測時間小于30s，方法定量限分別為6.2和9.8ng/kg，加標回收率94.5%～103.0%。單個豬肉樣品檢測耗量只需毫克級，可以達到“瘦肉精”檢測工作中節約樣品耗量、直接快速分析及多種類樣品檢測等基本要求，為食品監管中“瘦肉精”檢測提供一種快速高效的質譜分析新方法。

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AbstractSalbutamolandClenbuterolareoftenusedasβagonistsandillegallyaddedinpigfeed，resultinginporkcontaminatedandevenleadingathletesexcessiveexcitability.Therefore，ithasgreatsignificanceforestablishinganewrapiddetectionmethodofsalbutamolandclenbuterolinpork.Inthisstudy，internalextractionelectrosprayionizationmassspectrometry（iEESIMS）technologywasusedfordirectlyqualitativeandquantitativeanalysisofsalbutamolandclenbuterolinporktissueswithoutsamplepretreatment.Theresultsshowedthatthismethodhadahighsensitivitytosalbutamolandclenbuterolanalysiswithdetectionlimitsof（LOD）6.2and9.8ng/kg，respectively，whiletheanalysistimefordetectingsinglesampleandsingleindexwaslessthan30s.Inaconcentrationrangeof0.01-1000μg/kg，thelogarithmofsignalintensity（Y）andthelogarithmofconcentration（X）haveagoodlinearrelationship.Thismethodhasmanyadvantagessuchasrapidanalysis，lowsampleconsumptionandhighsensitivity，whichisidealforrapiddetectionoftracesalbutamolandclenbuterol.

KeywordsInternalextractionelectrosprayionization；Salbutamol；Clenbuterol；βAgonists；Organizationalanalysis

HQWT6JY（Received14July2016；accepted14September2016）

ThisworkwassupportedbytheprogramforchangjiangScholarsandInnovationResearchTeaminUniversities（No.IRT13054），JiangxiProvinceScienceandTechnologyLandmarkProject（No.KJLD13051），ChinaAcademyofMetrologyScienceandTechnology（No.40AKYKF1601）