茶樹磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運子CsPPT2基因的克隆和分析

紀(jì)志芳，甘玉迪，陳常頌，楊鼎俊，孫康，黎星輝，陳暄*

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所， 江蘇 南京 210095；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015

茶樹磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運子CsPPT2基因的克隆和分析

紀(jì)志芳1，甘玉迪1，陳常頌2，楊鼎俊1，孫康1，黎星輝1，陳暄1*

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所， 江蘇 南京 210095；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015

以茶樹（Camellia sinensis）白葉1號為材料，應(yīng)用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得茶樹磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運子家族一個基因 CsPPT2的 cDNA序列，并與茶樹體內(nèi)另一個磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運子家族的基因CsPPT1在不同時期和不同部位的表達(dá)進(jìn)行比較。CsPPT2的cDNA全長1 469 bp，其中開放閱讀框（ORF）為1 218 bp，編碼 406個氨基酸。通過生物學(xué)信息分析表明，CSPPT2蛋白分子量為 44.6 kD，理論等電點為9.90，CsPPT2有6個跨膜區(qū)，屬于疏水性葉綠體跨膜蛋白。聚類分析顯示，茶樹磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運子家族分為2個亞組，而CsPPT1與CsPPT2屬于不同亞組。熒光定量結(jié)果分析表明，兩個基因可能在茶樹體內(nèi)功能不同，CsPPT2在所考察的組織中均有表達(dá)，且在根和成熟葉片中表達(dá)量遠(yuǎn)大于CsPPT1；CsPPT1在莖和復(fù)綠前的幼嫩芽葉中表達(dá)量高于 CsPPT2。在白化期起始時 CsPPT2有短暫的升高，但伴隨白化受到較大的抑制，表明CsPPT2的表達(dá)抑制可能是白葉1號低兒茶素高氨基酸品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素。

茶樹；白葉1號；磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運子；CsPPT2；表達(dá)分析

磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運子（PPT）作為植物初級代謝和次級代謝體系的重要樞紐[1]，其生理功能是在C3植物中將PEP從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到質(zhì)體內(nèi)，通過莽草酸代謝途徑生成各類芳香族氨基酸或合成蛋白質(zhì)，或作為植物體內(nèi)其他許多次級代謝物質(zhì)的底物來源[2-3]。理論上，PPT基因突變是致死的，但在擬南芥 cue1（ Chlorophyll a/b binding protein gene underexpressed 1）[4-5]突變體的研究中發(fā)現(xiàn)是AtPPT1發(fā)生了突變，表現(xiàn)為葉片白化。進(jìn)一步的研究表明，擬南芥 cue1突變體未致死的原因在于擬南芥體內(nèi)除了突變的AtPPT1之外還存在著第2個PPT基因AtPPT2[6]，而維持突變體生存的原因是兩個基因在植物體內(nèi)的表達(dá)部位不相同，有一定的互補(bǔ)作用[7]。另有研究表明，PPT在不同植物器官中起著不同的作用，在葉片葉綠體以及一些生長的種子中PPT是作為輸入者將 PEP轉(zhuǎn)運至質(zhì)體中，而根中是作為溢流閥調(diào)節(jié) PEP在根中的積累量[8]。目前，在擬南芥、油菜、水稻中均對PPT1基因的功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)PPT1基因在油菜籽粒的油份等物質(zhì)中積累[9]，對擬南芥[7]和水稻[10]的葉色調(diào)控有一定的作用，而其他PPT基因除擬南芥外則鮮有研究。

白葉1號（安吉白茶）是一種自然突變體，因其春季新梢葉色的可逆性白化及白化期新梢較高的游離氨基酸含量而受到廣泛關(guān)注和利用[11-12]。根據(jù)白葉1號階段性白化過程中葉片顏色的變化可將白葉 1號新梢生育過程細(xì)分為5個典型的生育階段：返白前，白化初期，白化中期，白化盛期，復(fù)綠初期。白葉1號在每年春季新梢萌發(fā)時期，芽頭呈微綠色，當(dāng)葉片展開后很快白化成乳白色，白化現(xiàn)象在新梢一芽二葉期前后最為明顯，在春茶后期葉片顏色又逐步轉(zhuǎn)綠，直至完全復(fù)綠[13]。研究表明CsPPT基因相關(guān)功能對于探究白葉 1號白化期間兒茶素含量上升的機(jī)理具有重要參考價值，其中CsPPT1具有為莽草酸途徑提供PEP的作用[14]。本研究從家族內(nèi)另一個基因入手，克隆得到茶樹一個新的磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運子基因CsPPT2，并對其進(jìn)行了生物學(xué)信息分析，同時與CsPPT1進(jìn)行了不同組織、白化過程不同時期表達(dá)的比較分析，為深入研究該基因在白葉 1號白化過程中莽草酸途徑中各種次生代謝物含量的變化機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用茶樹品種白葉 1號采自南京仕必瑞生物科技有限公司，選擇茶樹白化的5個階段（返白前、白化初期、白化中期、白化盛期、復(fù)綠初期）的一芽二葉，另于2016年9月3日分別取一年生白葉1號茶樹的根、嫩莖、葉和葉脈，所取樣品立即放于液氮中冷凍，隨后儲存在–70℃冰箱保存待用。

EASYspin PlusRNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物，E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit D2500-02購自O(shè)MEGA。pEASY-T1 Simple克隆載體、pEASY-Blunt Zero克隆載體、Trans1-T1克隆感受態(tài)細(xì)胞購于南京百斯凱科技有限公司。Marker、PrimeSTAR ?HS DNA Polymerase、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit、Wizard DNA Clean-Up System（Promega）試劑盒、SYBRPremix Ex-Taq試劑盒等均購于TaKaRa公司，引物合成及測序由南京金斯瑞公司完成。

1.2 RNA的提取與cDNA的合成

使用EASYspin PlusRNA提取試劑盒提取茶樹不同時間段和不同組織的 RNA，利用微量紫外檢測儀NanoDrop測定RNA濃度。用PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 CsPPT2基因的克隆

根據(jù)NCBI GenBank中登錄的其他物種，如葡萄、蓖麻、草莓、大豆、黃瓜等的PPT2基因的序列設(shè)計本實驗所需的引物（表 1）。以茶樹芽頭 cDNA為模板進(jìn)行基因中間片段PCR擴(kuò)增，普通 PCR程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增體系為：ddH2O 11.9 μL，10× r-Taq Buffer (Mg2+free) 2 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1) 1.6 μL，MgCl2(25 mmol·L-1) 1.2 μL，上、下游引物各1 μL，Temple 1 μL，5 U·μL-1r-Taq 0.3 μL。3′-RACE 和5′-RACE擴(kuò)增同上述方法，拼接出茶樹PPT2全長序列。最后再設(shè)計特異引物，采用PrimeSTAR ?HS DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增出基因全長。瓊脂糖凝膠電泳分離 PCR產(chǎn)物后回收目的條帶。PCR 產(chǎn)物連接到pEASY-T1 Simple克隆載體并轉(zhuǎn)入Trans1-T1克隆感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行克隆鑒定和序列測序。

1.4 CsPPT2基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST進(jìn)行同源比對分析，用ORF Finder分析開放閱讀框；使用 MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行聚類分析；使用 ProtParam tool（http://web.expasy.org/ protparam）計算蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和理論等電點；利用 DNAMAN進(jìn)行蛋白質(zhì)親/疏水性分析；通過 TMHMM（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的分析；采用NetPhos Sever3.0（http://www.cbs. dtu.dk/services/NetPhos）進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測與分析；在線軟件TargetP 1.1 Serve（http://www. cbs.dtu.dk/services/TargetP）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

表1 CsPPT2克隆引物Table 1 Primer sequences for the amplification ofCsPPT2

1.5 實時熒光定量PCR反應(yīng)與基因表達(dá)分析

使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將反轉(zhuǎn)錄后，以茶樹β-actin基因（Accession No. HQ420251）作為看家基因[15]，利用IQTM5 multicolor real time PCR detection system（Bio-rad，USA）進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，PCR程序為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。20 μL體系為：ddH2O 8.2 μL，SYBR ExTaqⅡ 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL。采用法分析結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計處理，利用鄧肯式新復(fù)極差法做顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 茶樹CsPPT2基因的克隆Fig. 1 Amplification ofCsPPT2gene fromCamellia sinensis

2.1 CsPPT2基因的克隆

以茶樹芽頭cDNA為模板克隆CsPPT2基因：中間片段長度為638 bp（圖1-A），BlastX比對證明該片段與其他物種的PPT基因具有較高的相似性，以此片段為基礎(chǔ)設(shè)計基因特異性引物（表 1）獲得 992 bp的 3′端序列（圖1-B）和 475 bp的 5′端序列（圖 1-C）；經(jīng)DNAMAN 拼接后預(yù)測全長 cDNA的開放閱讀框（ORF），根據(jù)該序列設(shè)計ORF擴(kuò)增引物獲得長 1 218 bp的片段。ORF產(chǎn)物測序后與拼接結(jié)果比對，確認(rèn)獲得了 1 469 bp的茶樹CsPPT2基因的cDNA全長序列（圖1-D），編碼406個氨基酸（圖2）。

2.2 CsPPT1和CsPPT2氨基酸比較分析

對比CsPPT1和CsPPT2基因氨基酸序列，結(jié)果如圖3，二者相似性為62.04%，但2個基因的結(jié)構(gòu)域位置相似。

2.3 CsPPT2基因氨基酸序列的聚類分析

將茶樹CsPPT2基因氨基酸序列與GenBank中登錄的其他物種PPT基因的氨基酸序列進(jìn)行比對，利用MEGA5中的最大似然法制作CsPPT2與其他物種PPT基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行聚類分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，整個PPT家族大致可以分為2類，PPT1、PPT2。CsPPT1和CsPPT2分別屬于不同的亞組。其中CsPPT1與單子葉植物玉米、水稻和粟的親緣關(guān)系更近，CsPPT2與雙子葉植物芝麻和番茄親緣關(guān)系較近。與擬南芥中情況不同的是，在茶樹中，與 C4植物的PPT基因親緣關(guān)系更近的是CsPPT1。

2.4 CsPPT2基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.4.1CsPPT2基因氨基酸序列的理化性質(zhì)分析

CsPPT2基因?qū)?yīng)的氨基酸序列分析結(jié)果表明，茶樹CsPPT2基因編碼的氨基酸數(shù)目為406個（圖 2），分子量為 44 627.44，理論等電點為 9.90。負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)為（Asp+Glu）16個，正電荷殘基數(shù)為（Arg+Lsy）34個。不穩(wěn)定系數(shù)為39.16，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為105.89，總平均親水性為0.453。

2.4.2CsPPT2基因跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖2 CsPPT2基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig. 2 Deduced nucleotide and amino acid sequences ofCsPPT2gene

圖3 CsPPT1與CsPPT2基因氨基酸序列比對Fig. 3 Alignment of amino acid sequences ofCsPPT1andCsPPT2

圖4 CsPPT2的聚類分析Fig. 4 Phylogenetic tree ofCsPPT2

采用TMHMM分析發(fā)現(xiàn)，CsPPT2共有6個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖 5），預(yù)測位置分別在105～122、132～154、167～189、227～249、279～301、372～394。推測該蛋白可能為跨膜蛋白。茶樹CsPPT2蛋白氨基酸N端和C端均處于細(xì)胞膜內(nèi)部。與CsPPT1不同的是，CsPPT1有7個跨膜區(qū)域。

2.4.3CsPPT2基因亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用 TargetP 1.1 Server在線軟件預(yù)測CsPPT2蛋白的亞細(xì)胞定位情況如表 2。顯示葉綠體轉(zhuǎn)運肽定位的可能性最大，得分為0.986 ，而作為線粒體靶向肽和信號肽定位的可能性很小，得分僅為0.021和0.003。

2.4.4CsPPT2基因親/疏水性分析

利用 Protscal在線預(yù)測軟件繪制茶樹CsPPT2的親/疏水性序列圖譜（圖6），發(fā)現(xiàn)，茶樹CsPPT2親水性氨基酸少于疏水性氨基酸，根據(jù)正值越大疏水性越大的規(guī)律判斷，茶樹CsPPT2蛋白屬于疏水性蛋白。

2.4.5CsPPT2磷酸化位點預(yù)測

磷酸化修飾預(yù)測發(fā)現(xiàn)整個蛋白質(zhì)多肽鏈中分值大于 0.5的氨基酸位點共有 42個，且非均勻分布在整個多肽鏈中，其中 27個絲氨酸殘基（Ser）可能發(fā)生磷酸化，分別位于肽鏈的第9、17、35、40、41、42、44、48、52、54、57、60、66、85、96、165、178、187、194、238、250、266、307、309、316、369、378個位點；13個蘇氨酸殘基（Thr）可能發(fā)生磷酸化，分別位于肽鏈的第 12、65、93、135、137、145、158、163、178、184、198、220、375個位點；1個酪氨酸殘基（Tyr）可能發(fā)生磷酸化，位于肽鏈的第4個位點（圖7）。

2.5 CsPPT1和CsPPT2基因相對表達(dá)量比較分析

分別提取一年生白葉1號茶苗不同部位，包括根、嫩莖、葉、葉脈白葉 1號在白化前期、白化期和白化后期一芽二葉葉片的mRNA進(jìn)行實時熒光定量 RT-PCR分析（圖8）。CsPPT2在茶樹的根、莖、葉、葉脈中均有表達(dá)，表達(dá)量由高到低依次為：根、葉、嫩莖和葉脈，其中，在根中表達(dá)量最多。

圖5 CsPPT2的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 5 The predictedCsPPT2transmemberence domains

表2 CsPPT2的亞細(xì)胞定位的預(yù)測Table 2 The subcellular localization prediction ofCsPPT2

圖6 CsPPT2疏水性預(yù)測Fig. 6 Predicted hydrophobic properties ofCsPPT2

圖7 CsPPT2磷酸化預(yù)測Fig.7 Phosphorylation prediction ofCsPPT2

將CsPPT1和CsPPT2不同部位的基因表達(dá)量進(jìn)行比較分析可以看到，兩個基因在根、莖、葉和葉脈中都有表達(dá)，CsPPT2在根和葉中表達(dá)顯著高于CsPPT1，尤其在根部其表達(dá)量可達(dá)CsPPT1表達(dá)量的 40倍，而CsPPT1則在莖中表達(dá)多于CsPPT2（圖8）。

在白化過程的不同時期，CsPPT1的表達(dá)量均高于CsPPT2，而且，結(jié)果顯示白化開始后CsPPT1呈下降的趨勢，CsPPT2也在白化中期急劇下降（圖9）。

圖8 CsPPT1和CsPPT2在茶樹不同組織的表達(dá)量Fig. 8 The expression profiles ofCsPPT1 andCsPPT2in different tissues

圖9 CsPPT1和CsPPT2在茶樹新梢不同生育階段的表達(dá)量Fig. 9 The expression profiles ofCsPPT1 andCsPPT2in different stages

3 結(jié)論與討論

磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）作為植物初生和次生代謝重要的平衡點，但在 C3植物，如豌豆、菠菜、擬南芥、花菜等[16-19]的葉綠體和絕大多數(shù)非綠質(zhì)體內(nèi)沒有從糖酵解完全合成PEP所需要的所有酶，所以并不具備合成PEP的能力。因此，葉綠體內(nèi)的PEP只能通過磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運子（PPT）從細(xì)胞質(zhì)獲取[20]，所以，PPT在C3植物中起著初級和次級代謝途徑的橋梁作用[1]，PPT功能對植物的重要性由此可見。

在擬南芥中，有兩個功能性的PPT基因，分別是AtPPT1和AtPPT2，而AtPPT1的突變會導(dǎo)致一系列的表型如葉片白化、氨基酸含量上升及莽草酸途徑產(chǎn)物減少等現(xiàn)象[2,21]，這與白葉1號白化期表型基本一致。與擬南芥不同的是，通過對白葉1號不同組織實時熒光定量發(fā)現(xiàn)，CsPPT2在所考察的組織中均有表達(dá)，且根和成熟葉片中大量表達(dá)，CsPPT1相對于CsPPT2表達(dá)量均低，但在嫩莖中和嫩葉中表達(dá)量高于CsPPT2，這說明CsPPT2可能在茶樹中發(fā)揮著主要的作用。在擬南芥中AtPPT1主要在葉和根的維管組織中表達(dá)，AtPPT2在幾乎所有的葉片中表達(dá)，而不在根部表達(dá)[6]；而CsPPT2在茶樹根和葉中卻大量表達(dá)，這表明在茶樹體內(nèi)主要由CsPPT2完成PEP的轉(zhuǎn)運等生理功能，所以當(dāng)CsPPT2表達(dá)發(fā)生變化會引起茶樹體內(nèi)莽草酸途徑的變化，從而對白葉1號的品質(zhì)產(chǎn)生影響。與CsPPT1僅在幼嫩組織中表達(dá)不同，CsPPT2在白化期開始表達(dá)量略有上升而后卻劇烈下降，結(jié)合CsPPT2在成熟葉片中較大的表達(dá)量可以看出，在茶樹新梢萌芽過程中，CsPPT1首先發(fā)揮作用，但隨著葉片的成長發(fā)育，其功能由CsPPT2取代，本應(yīng)隨著葉片的成熟表達(dá)量逐步上升，CsPPT2的表達(dá)在白化過程中受到了較強(qiáng)的抑制，也就是白化過程首先延緩CsPPT2的正常表達(dá)，影響了茶樹葉片中 PEP的正常運輸，導(dǎo)致莽草酸合成途徑受到抑制，使得新梢中兒茶素含量降低；不能進(jìn)入葉綠體的 PEP在胞質(zhì)中積累導(dǎo)致胞質(zhì)中丙酮酸含量上升，刺激TCA循環(huán)，使得谷氨酸積累，導(dǎo)致茶氨酸合成途徑增強(qiáng)，含量上升，最終形成白葉1號低兒茶素高氨基酸的品質(zhì)。

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Cloning and Expression Analysis of Phosphoenolpyruvate Transporter Gene CsPPT2 in Tea Plant(Camellia sinensis)

JI Zhifang1, GAN Yudi1, CHEN Changsong2, YANG Dingjun1, SUN Kang1, LI Xinghui1, CHEN Xuan1*

1. Tea Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fu′an 355015, China

A full length cDNA sequence of phosphoenolpyruvate transporter gene (CsPPT2) was obtained from tea plant(Camellia sinensis) cultivar ‘Baiye 1’ by polymerase chain reaction (PCR) and rapid amplification of cDNA ends PCR(RACE-PCR). The nucleotide sequence length of this gene was 1469 bp, containing a complete open reading frame (1218 bp) encoding 406 amino acids. Bioinformatic analysis showed that the predicted molecular weight of the protein was 44.6 kD, and the theoretic isoelectric point was 9.90. CsPPT2 has 6 trans-membrane regions, which may belong to the hydrophobic chloroplast trans-membrane protein. Phylogenetic tree analysis showed the phosphoenolpyruvate transporter family in tea plant could be divided into two subgroups, with CsPPT1 and CsPPT2 belonged to different subgroups. The expression of CsPPT1 and CsPPT2 were compared in different periods and plant organs. It showed that CsPPT2 was expressed in all tested tissues, with higher expression level in roots and mature leaves than those of CsPPT1. But the expression level of CsPPT1 in young shoots was higher than CsPPT2. CsPPT2 was transiently elevated at the beginning of the albino, but inhibited during the development ofalbino, indicates that the inhibition of the expression of CsPPT2 may act as a key factor for low-catechins and high-amino acids in ‘Baiye 1’.

Camellia sinensis, Baiye 1, phosphoenolpyruvate transporter, CsPPT2, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2017)02-149-11

2017-02-14

2017-02-22

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-23）、江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目、國家自然科學(xué)基金（31570691）、江蘇省科技支撐計劃（BE2009313-1）

紀(jì)志芳，女，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種和茶葉生化研究。*通訊作者：chenxuan@njau.edu.cn