六堡茶急性和亞急性毒性安全性評價研究

吳文亮，林勇，劉仲華，黃建安，龍志榮，滕翠琴，馬士成，邱瑞瑾，曹中環(huán)

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3. 植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128；4. 梧州市六堡茶研究院，廣西 梧州 543003；5. 梧州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 梧州543003；6. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，湖南 長沙 410125

六堡茶急性和亞急性毒性安全性評價研究

吳文亮1,2,3,6，林勇1,2,3*，劉仲華1,2,3，黃建安1,2,3，龍志榮4,5，滕翠琴4,5，馬士成4,5，邱瑞瑾4,5，曹中環(huán)4,5

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3. 植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128；4. 梧州市六堡茶研究院，廣西 梧州 543003；5. 梧州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 梧州543003；6. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，湖南 長沙 410125

六堡茶產(chǎn)制歷史悠久，是廣西特色名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品，但其安全性研究不夠。為了探明六堡茶飲用的安全性，本實驗以廣西梧州六堡茶為原料，采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法分析六堡茶常規(guī)理化成分；并按照食品安全性毒理學(xué)評價程序，進(jìn)行較系統(tǒng)的六堡茶急性毒性和亞急性毒性實驗。結(jié)果表明：六堡茶理化指標(biāo)符合廣西地方標(biāo)準(zhǔn)，且3個批次有較好的重復(fù)性；在小鼠急性毒性試驗中，采用bliss法計算得出六堡茶半數(shù)致死劑量（LD50）為9.38 g·kg-1，95%的可信限為8.43～10.44 g·kg-1，大于5 g·kg-1的經(jīng)口急性毒性標(biāo)準(zhǔn)；采用大鼠30 d喂養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，期間動物的生長發(fā)育良好，六堡茶 3個劑量組（0.47 g·kg-1·d-1、0.94 g·kg-1·d-1、1.88 g·kg-1·d-1）的動物體質(zhì)量、血常規(guī)指標(biāo)、血生化指標(biāo)、臟器指數(shù)與對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。因此從食品毒理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)來看，六堡茶屬于無毒級食品，符合食品安全性要求。

六堡茶；急性毒性；亞急性毒性；半致死劑量

六堡茶作為黑茶家族的重要成員，是廣西特色名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品，因原產(chǎn)于廣西梧州市蒼梧縣六堡鎮(zhèn)而得名，至今已有一千五百多年的歷史，遠(yuǎn)銷日本、東南亞各國及粵港澳地區(qū)，是廣西傳統(tǒng)的出口產(chǎn)品[1]。近年來，隨著黑茶的熱銷，使得同屬黑茶類的六堡茶倍受消費(fèi)者青睞，六堡茶消費(fèi)市場不斷升溫，現(xiàn)在也日漸為內(nèi)地其他地方消費(fèi)者認(rèn)可；品牌價值不斷提升，目前年產(chǎn)量已超1萬t，產(chǎn)值達(dá)10億元以上，2016年6月《2016中國茶葉區(qū)域公用品牌價值排行榜》發(fā)布，六堡茶品牌價值 15.79億元，居中國茶葉區(qū)域品牌價值第28位、黑茶類第3位、廣西茶類第1位。

根據(jù)世界貿(mào)易組織（WTO）的有關(guān)協(xié)定要求和食品法典委員會（CAC）的有關(guān)準(zhǔn)則，食品安全性評價是食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制定的重要依據(jù)[2]。同時，應(yīng)用食品毒理學(xué)的方法對食品進(jìn)行安全性評價，可為我們正確認(rèn)識和開發(fā)食品新資源提供可靠的技術(shù)保障。六堡茶作為我國傳統(tǒng)飲品，已有較久的安全飲用歷史，從某種意義上講，可基本認(rèn)為飲用六堡茶的主導(dǎo)產(chǎn)品是安全的，但六堡茶生產(chǎn)中存在一系列微生物參與的渥堆工序，增加了成品茶代謝產(chǎn)物及生化成分的復(fù)雜性和鑒定難度。因此對六堡茶進(jìn)行有效的安全性毒理學(xué)評價是保證六堡茶質(zhì)量安全，保障出口（衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)與國際接軌），促進(jìn)茶葉消費(fèi)和產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的必由之路。

從目前的黑茶安全性研究來看，僅見對云南普洱茶和湖南安化黑茶進(jìn)行過較為系統(tǒng)的安全性毒理學(xué)評價[2-6]。而作為黑茶大家族中的一個很重要成員——廣西六堡茶的安全性評價研究涉及較少，尤其是特別重要的六堡茶急性及亞急性毒性安全性評價研究缺乏相關(guān)確切的試驗數(shù)據(jù)[7]。這樣必然會影響到六堡茶及整個黑茶產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。基于此，本研究以六堡茶質(zhì)量安全特性為出發(fā)點(diǎn)，參照食品安全性毒理學(xué)評價程序[8-9]，開展六堡茶的急性及亞急性毒理學(xué)試驗并對質(zhì)量安全問題進(jìn)行理論分析，為促進(jìn)六堡茶及黑茶消費(fèi)熱的興起提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 茶葉原料

六堡茶（三鶴牌，批號：0128、0211、0401）由廣西壯族自治區(qū)梧州茶廠提供。

1.1.2 試驗動物

昆明種（KM）小鼠，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量 18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，試驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2011-003。

SD大鼠，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量60～80g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，試驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2013-004。

基礎(chǔ)飼料主要營養(yǎng)成分：粗蛋白24.3%，粗脂肪7.5%，粗纖維3.5%，粗灰粉8.6%，鈣1.16%，磷0.7%，含水量7.5%。

1.1.3 試驗儀器

LC10AT-VP Plus高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司），UV-2550型紫外分光光度計（日本 Shimadzu公司），TBA-40FR型全自動生化分析儀（日本東芝公司），血液細(xì)胞分析儀（美國貝克曼公司），MODULYOD-230冷凍干燥機(jī)（廣州三元科技有限公司），EASYpureⅡ純水儀（杭州普瑞科技有限公司），SK3300LH超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司），ABl04-N電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），灌胃器等。1.1.4 試驗試劑

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase，AST)、血糖（Glucose，Glu）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒均購自上海科華生物工程股份有限公司（批號：20160622）。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樣干粉制備

取六堡茶樣品100 g，用沸水3次浸提（每次的料液比為 1∶10，浸提時間分別為 20 min），紗布過濾，合并3次浸提茶湯，減壓濃縮至 100 mL，再將濃縮的茶湯于－20℃預(yù)凍12 h，放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥后收集、稱重、密封包裝，－20℃保存。

1.2.2 茶樣常規(guī)成分測定

水浸出物的測定按GB/T 8302—2002《茶水浸出物測定》方法，水分的測定按 GB/T 8304—2002《茶 水分測定》方法，茶多酚的測定按GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，咖啡堿的測定按GB/T 8312—2002《茶 咖啡堿測定》方法，氨基酸的測定按GB/T 8314—2002《茶 游離氨基酸總量測定》方法。

1.2.3 動物實驗

急性毒性試驗：①預(yù)測試動物全死和不死劑量：參照文獻(xiàn)[2]的方法，取體質(zhì)量18～22 g健康昆明小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后，用蒸餾水溶解茶樣干粉配置1個高濃度的茶樣劑量（0.3 g·mL-1），再稀釋設(shè)置組距3～10倍的多個劑量組，以4只小鼠為1組，對各組試驗小鼠采用經(jīng)口灌胃，每次灌胃劑量20 mL·kg-1；對高劑量組采取1日內(nèi)2或3次灌胃，每次間隔4 h。常規(guī)觀察飼養(yǎng) 7 d，記錄各組動物死亡和中毒癥狀，測試出茶樣的全死和不死劑量。②茶樣LD50的測定：根據(jù)上述預(yù)測試結(jié)果，參照文獻(xiàn)方法[3,10]對茶樣分別在全死與無死劑量間按 0.8等比設(shè) 4～6個劑量組，每個劑量組用18～22 g小鼠10只，雌雄各半，另設(shè)純水對照組。試驗時，小鼠禁食給水 12 h后，以 20 mL·kg-1的灌胃劑量對每只小鼠灌胃一定濃度的茶湯。對于高劑量組，可以采取1日內(nèi)多次灌胃，每次間隔4 h。對灌胃后小鼠活動狀況、死亡時間、體質(zhì)量及取食狀況進(jìn)行觀察記錄，并對死亡動物進(jìn)行剖檢。檢查各組織和臟器的體積、顏色、質(zhì)地等有無異常，如有異常及時取材，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。觀察 14 d后用Bliss法對各茶樣劑量組的動物死亡情況進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗期間動物飼養(yǎng)環(huán)境：室內(nèi)氣溫20～25℃，濕度70%～90%，光照12 h·d-1。

亞急性毒性試驗：①大鼠30 d喂養(yǎng)實驗：取4周齡健康SD大鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后，隨機(jī)分4個組（空白對照組、六堡茶低劑量組、中劑量組、高劑量組），每組20只，雌雄各半，分籠喂養(yǎng)。按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》的毒理學(xué)檢驗方法的要求[8]，茶 湯劑量分 別為 470 mg·kg-1·d-1、 940 mg·kg-1·d-1、1 880 mg·kg-1·d-1（1/20 LD50、1/10 LD50、1/5 LD50），每天灌服1次，連續(xù)30 d，每周稱體質(zhì)量一次，同時設(shè)對照組，灌胃蒸餾水。②指標(biāo)觀察與檢測：每天觀察大鼠的行為、活動、飲食、睡眠、毛色、糞便等的變化。實驗?zāi)┢冢笫蠼尺^夜后，稱體質(zhì)量，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，眼眶取血2份，一份血樣抗凝處理用動物血液細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞數(shù)目（WBC）、紅細(xì)胞數(shù)目（RBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、平均血小板體積（MPV）、淋巴細(xì)胞比值（Lymph）、單核細(xì)胞比例（Mon）、粒細(xì)胞比例（Gran）、等；另一份血樣分離血清用全自動生化分析儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、血糖（Glu）。然后處死和解剖大鼠，進(jìn)行大體觀察，取肝、心、脾、肺、腎、睪丸稱重，并計算臟器指數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)分析用SPSS 10.0 for Windows統(tǒng)計學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)化學(xué)成分測定結(jié)果

食品毒理學(xué)為開發(fā)食品新資源提供可靠的技術(shù)保障，化學(xué)分析法是食品毒理學(xué)評價的重要手段，為正確認(rèn)識和安全使用食品及添加劑提供有效的技術(shù)支持。六堡茶生化成分的分析研究已有報道，茶葉的常規(guī)成分測定是對實驗茶樣的情況作簡要判斷。本試驗選檢幾個主要測試項目，以對所試茶樣的情況作簡要界定。結(jié)果如表1所示，3個批次六堡茶樣品的常規(guī)成分中水浸出物、水分、茶多酚、咖啡堿和氨基酸總量平均含量分別 為 (36.79±1.56)% 、 (10.13±0.78)% 、(11.54±1.06)%、(3.21±0.24)%和(1.63±0.12)%，符合六堡茶的廣西地方標(biāo)準(zhǔn)，表明所選茶樣的常規(guī)成分具有較好的代表性。

表1 六堡茶常規(guī)成分測定結(jié)果Table 1 Measured results of conventional composition in Liupao tea %

2.2 急性毒性試驗結(jié)果

2.2.1 經(jīng)口灌胃后一般觀察及急性毒性結(jié)果

由預(yù)試得出小鼠灌胃給予不同劑量茶樣后產(chǎn)生 0～100%死亡率的劑量大致是：6～15 g·kg-1，故以15 g·kg-1作為本試驗的最高劑量，按 0.8等比設(shè)置 6個茶湯劑量進(jìn)行六堡茶急性毒性試驗。實驗數(shù)據(jù)及結(jié)果如表 2所示，在灌胃茶湯劑量為6.1 g·kg-1及以下時，小鼠全部存活無死亡現(xiàn)象，且表現(xiàn)較為活躍，活動增加，對刺激較為敏感，均未見有明顯毒性反應(yīng)現(xiàn)象。從7.7 g·kg-1劑量開始，小鼠出現(xiàn)死亡，大多數(shù)死亡時間都是在灌胃后 4 h以后，中毒反應(yīng)基本于灌胃后20 min左右出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為活動減少、震顫、豎尾、呼吸減慢、驚厥等，且其程度隨著劑量增加而增加，深度中毒者于灌胃后30 min開始死亡；在茶湯劑量為 12 g·kg-1的實驗組中只有 1只小鼠存活，且存活小鼠灌胃后10 min即表現(xiàn)活動減少、閉眼、強(qiáng)直震顫、取食減少等，次日才開始恢復(fù)睜眼取食、活動增加；而在劑量為 15 g·kg-1的實驗組中小鼠全部死亡。對死亡小鼠進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，沒有發(fā)現(xiàn)器官異常現(xiàn)象；對照急性毒性試驗觀察的動物反應(yīng)指標(biāo)[11]表明，中毒部位可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。

2.2.2 急性毒性統(tǒng)計結(jié)果分析

六堡茶的急性毒性統(tǒng)計分析結(jié)果如表 3所示。急性毒性試驗中半致死劑量（LD50）的計算有多種方法[12]，本試驗采用Bliss法對茶樣的急性毒性實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，其結(jié)果如下：計算得出六堡茶的半致死劑量 LD50為9.38 g·kg-1，由于試驗誤差的不確定性，其LD50有95%的可能性在8.43～10.44 g·kg-1之間，回歸方程為y=－6.845+12.182Log(x)。根據(jù)1977年 WHO頒布的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[12]以及國家頒布分級標(biāo)準(zhǔn)，六堡茶的經(jīng)口急性毒性的 LD50大于 5 g·kg-1，因此，六堡茶樣可以判定為 2級（實際無毒）。

表2 急性毒性實驗動物死亡情況Table 2 The animal death of acute toxicity experiment

表3 急性毒性實驗統(tǒng)計分析結(jié)果Table 3 Statistical analysis of acute toxicity experiments

2.2.3 對各組小鼠體質(zhì)量的影響

在急性毒性實驗灌胃后對存活的小鼠進(jìn)行稱重觀察，計算其平均體質(zhì)量和偏差值。結(jié)果如表4所示，六堡茶灌胃處理后，各劑量組存活小鼠在1～3 d內(nèi)體質(zhì)量增加緩慢。與對照組相比，基本上呈顯著性差異（P＜0.05）。灌胃5 d和7 d以后，小鼠體質(zhì)量增速有所加快，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；與對照組比較，低劑量組（4.9 g·kg-1和6.1 g·kg-1）小鼠體質(zhì)量無顯著性差異，高劑量組（7.7～12 g·kg-1）基本呈現(xiàn)了顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。這些結(jié)果表明低劑量六堡茶湯灌胃對小鼠體質(zhì)量影響較小，接近于半致死劑量的六堡茶湯灌胃對小鼠體質(zhì)量影響較大，可能由于六堡茶濃度過高引起中毒而造成機(jī)體損傷。

2.2.4 半致死劑量與內(nèi)含成分含量的關(guān)系

為了探討六堡茶可能的致死原因，我們初步分析了六堡茶半致死劑量與主要內(nèi)含成分茶多酚和咖啡堿含量的關(guān)系。陸益等[13]的研究表明，茶多酚的 LD50為 2 640 mg·kg-1；根據(jù)我國食品添加劑手冊記載：咖啡堿對小鼠的LD50為 127～248 mg·kg-1[14]。本研究結(jié)果如表5所示，六堡茶 LD50灌胃劑量時茶多酚和咖啡堿含量分別為1082 mg·kg-1和301 mg·kg-1，已大于咖啡堿的 LD50，同時也接近茶多酚的LD50的一半。由此可以推斷，小鼠死亡的原因可能與過高濃度的咖啡堿甚至茶多酚中毒有關(guān)。

表4 各組動物平均體質(zhì)量情況Table 4 Weight of animals in each group

表5 六堡茶半致死劑量時的茶多酚和咖啡堿含量Table 5 Contents of tea polyphones and caffeine in Liupao tea of LD50

表6 六堡茶水提物對大鼠體質(zhì)量的影響Table 6 Effect of Liupao tea extract on the body weight of rats g

表6 六堡茶水提物對大鼠體質(zhì)量的影響Table 6 Effect of Liupao tea extract on the body weight of rats g

注：試驗總天數(shù)為30 d，第4周的天數(shù)為9 d。Note: The total number of days for the test is 30 days. The number of days for fourth week was set to 9 days.

性別Sex組別Groups初重Initial weight第1周First week第2周Second week第3周Third week第4周Fourth week♂空白對照組 69.5±6.6 113.5±12.3 161.3±10.9 198.5±16.3 239.2±15.4六堡茶低組 69.8±8.3 110.8±10.2 158.5±18.4 194.5±21.4 235.7±18.0六堡茶中組 70.1±5.4 114.3±14.6 160.2±20.3 196.5±15.8 232.5±15.9六堡茶高組 68.7±7.5 111.6±9.1 156.2±15.7 189.7±22.1 228.9±17.3♀空白對照組 67.9±7.2 104.7±10.8 143.6±16.5 168.9±15.9 197.1±13.8六堡茶低組 66.1±6.7 103.9±8.5 145.2±14.8 170.3±17.6 196.5±12.7六堡茶中組 65.3±5.8 104.4±15.1 141.9±13.4 164.6±14.7 190.8±16.4六堡茶高組 67.5±6.2 101.8±14.6 143.0±17.6 165.5±20.5 191.0±18.8

2.3 亞急性毒性試驗結(jié)果

2.3.1 動物一般表現(xiàn)

在連續(xù)30 d的灌胃過程中，與對照組比，各給藥組動物只在初灌六堡茶水提物后活動略減少，未見飲食、睡眠、毛色、糞便、自主活動等方面的明顯異常，表明連續(xù) 30 d給大鼠灌服六堡茶水提物，對大鼠一般狀況無明顯影響。

2.3.2 六堡茶對大鼠體質(zhì)量的影響

試驗結(jié)果見表 6。以 470、940和 1 880 mg·kg-1·d-13個劑量的六堡茶樣給大鼠灌胃30 d，實驗期間，各劑量組雌雄大鼠每周的體質(zhì)量與對照組比較，體質(zhì)量有減輕的趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明長期灌胃六堡茶水提物對大鼠的體質(zhì)量增長無明顯影響。

2.3.3 對大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響

以不同劑量的六堡茶水提物給大鼠灌胃30 d后，將每組大鼠活體取血進(jìn)行血象檢查。表7顯示，與對照組相比，各劑量組雌雄大鼠的紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDW）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、平均血小板體積（MPV）均無顯著差異（P＞0.05），且都在正常范圍之內(nèi)。表8也指出，灌胃六堡茶水提物對雌雄大鼠的白細(xì)胞總數(shù)（WBC）及其分類（淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）影響不顯著（P＞0.05）。這些結(jié)果說明長期飲用六堡茶對大鼠血液常規(guī)指標(biāo)無明顯不良影響。

2.3.4 對大鼠主要臟器指數(shù)的影響

以3個劑量的六堡茶給大鼠灌胃30 d后，將大鼠處死解剖，取肝、腎、脾、肺、睪丸、卵巢，稱重并計算臟器指數(shù)（表 9）。與空白對照組比較，六堡茶各劑量組大鼠的臟器指數(shù)差異性均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明長期飲用六堡茶對大鼠臟器指數(shù)無影響。

2.3.5 對大鼠血液生化指標(biāo)及肝功能的影響

如表10所示，以3個劑量的六堡茶給大鼠灌胃 30 d后，將所有老鼠活體取血進(jìn)行血液生化指標(biāo)及肝功能檢查。與正常組相比，六堡茶各劑量組大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、血糖（GLU）水平基本沒有明顯的差異（P＞0.05），但 TG和TC的水平有降低的趨勢。這些結(jié)果說明六堡茶對大鼠代謝和肝腎功能無明顯不良影響，且能促進(jìn)脂質(zhì)的代謝。

3 討論

目前六堡茶安全性研究還不夠細(xì)致深入，尤其是急性和亞急性毒性試驗涉及較少，但它是安全性毒理學(xué)評價中最重要的一個環(huán)節(jié)，最能直觀體現(xiàn)出六堡茶的毒性大小。

表7 六堡茶水提物對大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響Table 7 Effect of Liupao tea extract on the haematological index of rats

表7 六堡茶水提物對大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響Table 7 Effect of Liupao tea extract on the haematological index of rats

性別Sex組別Groups紅細(xì)胞總數(shù)RBC/×1012·L-1紅細(xì)胞壓積HCT/%平均紅細(xì)胞體積MCV/f L紅細(xì)胞分布寬度變異系RDW/%平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度MCHC/g·L-1平均血小板體積MPV/f L♂空白對照組 6.9±0.5 41.3±1.7 62.9±3.5 12.2±1.4 338.2±8.6 6.5±1.1六堡茶低組 6.6±0.7 42.4±2.8 63.3±4.1 10.9±1.5 337.4±6.3 6.2±0.9六堡茶中組 6.8±0.5 39.8±2.5 61.8±2.9 11.6±0.8 343.6±7.0 5.8±0.4六堡茶高組 6.4±0.8 38.5±6.9 62.1±3.8 11.4±1.0 339.1±7.2 5.9±0.5♀空白對照組 7.1±0.2 40.7±4.2 64.1±2.5 12.8±0.8 330.2±7.5 6.2±0.7六堡茶低組 7.2±0.5 39.6±2.7 62.4±4.2 12.3±0.6 327.7±8.1 6.3±1.0六堡茶中組 7.0±0.4 41.1±3.8 61.8±1.8 11.9±1.2 326.8±4.6 5.9±0.8六堡茶高組 6.9±0.2 39.2±3.6 61.4±3.1 11.8±1.4 333.2±9.0 5.6±1.2

表8 六堡茶水提物對大鼠白細(xì)胞的影響Table 8 Effect of Liupao tea extract on the white blood cell of rats

表8 六堡茶水提物對大鼠白細(xì)胞的影響Table 8 Effect of Liupao tea extract on the white blood cell of rats

性別Sex組別Groups白細(xì)胞數(shù)目WBC/×109·L-1白細(xì)胞分類Classification of white blood cell/%淋巴細(xì)胞 Lymph 單核細(xì)胞 Mon 中性粒細(xì)胞 Gran♂空白對照組 10.4±3.2 73.8±3.4 5.1±0.9 21.1±2.9六堡茶低組 10.1±4.7 74.1±5.2 4.6±0.7 21.3±5.2六堡茶中組 11.6±3.8 73.6±1.3 4.4±0.8 22.0±4.3六堡茶高組 12.7±3.5 73.3±2.6 4.5±0.5 22.2±3.2♀空白對照組 9.8±4.1 73.5±4.1 5.5±0.5 21.0±4.5六堡茶低組 10.4±3.6 72.3±6.3 5.6±0.6 22.1±3.7六堡茶中組 9.6±3.2 73.0±3.8 5.1±0.4 21.9±3.8六堡茶高組 11.3±2.9 72.7±4.0 4.9±0.9 22.4±5.0

表9 六堡茶對大鼠主要臟器指數(shù)的影響Table 9 Effect of liupao tea on the main organ index of rats %

表9 六堡茶對大鼠主要臟器指數(shù)的影響Table 9 Effect of liupao tea on the main organ index of rats %

性別Sex組別Groups肝Liver腎Kidney脾Spleen睪丸或卵巢Testis or ovary心Heart肺Lung♂空白對照組 3.04±0.15 0.80±0.08 0.22±0.05 0.92±0.09 0.35±0.05 0.47±0.04六堡茶低組 3.17±0.24 0.84±0.07 0.23±0.03 0.94±0.10 0.35±0.08 0.48±0.05六堡茶中組 3.03±0.29 0.84±0.10 0.21±0.03 1.02±0.14 0.38±0.06 0.50±0.08六堡茶高組 3.15±0.31 0.87±0.12 0.25±0.02 0.98±0.07 0.37±0.03 0.51±0.06♀空白對照組 3.16±0.30 0.85±0.06 0.23±0.04 0.07±0.01 0.36±0.08 0.50±0.07六堡茶低組 3.21±0.26 0.88±0.10 0.25±0.07 0.07±0.02 0.37±0.05 0.49±0.10六堡茶中組 3.13±0.32 0.86±0.07 0.28±0.11 0.08±0.01 0.40±0.11 0.52±0.08六堡茶高組 3.28±0.21 0.90±0.05 0.26±0.06 0.08±0.03 0.39±0.07 0.53±0.12

表10 六堡茶對大鼠血液生化指標(biāo)及肝功能的影響Table 10 Effect of Liupao tea on blood biochemical parameters and liver functions of rats

表10 六堡茶對大鼠血液生化指標(biāo)及肝功能的影響Table 10 Effect of Liupao tea on blood biochemical parameters and liver functions of rats

性別 Sex 組別 Groups ALT/U·L-1 AST/U·L-1 TC/mmol·L-1 TG/mmol·L-1 HDL-C/mmol·L-1 GLU/mmol·L-1♂空白對照組 51.3±3.4 194.5±31.8 2.34±0.43 1.04±0.16 1.05±0.12 6.98±1.31六堡茶低組 52.6±9.0 200.7±30.5 2.26±0.25 0.93±0.13 0.98±0.21 6.85±0.90六堡茶中組 58.1±10.8 212.4±38.1 2.18±0.41 1.01±0.22 1.01±0.19 7.04±0.58六堡茶高組 55.9±6.5 199.6±45.2 2.25±0.35 0.97±0.31 0.94±0.17 7.09±0.82♀空白對照組 49.7±6.2 191.3±36.9 2.30±0.57 1.08±0.19 1.16±0.20 7.07±0.36六堡茶低組 49.3±10.5 196.9±22.8 2.07±0.44 1.01±0.28 0.98±0.22 7.12±0.55六堡茶中組 53.6±7.1 201.8±31.4 2.23±0.40 0.99±0.32 1.07±0.16 7.03±1.09六堡茶高組 54.1±5.8 206.5±29.6 2.15±0.62 0.95±0.24 1.02±0.24 7.08±0.67

本研究在急性毒性試驗中測得六堡茶半致死劑量為 9.38 g·kg-1，大于 5 g·kg-1的經(jīng)口急性毒性標(biāo)準(zhǔn)，可以判定為實際無毒。從小鼠中毒及死亡癥狀如強(qiáng)直震顫、搖頭、呆滯、閉眼、豎尾驚厥、臨死前僅幾秒鐘的掙扎，可以初步推測六堡茶致小鼠中毒及死亡為中樞神經(jīng)毒性引起；六堡茶內(nèi)含成分分析表明，半死劑量的六堡茶含有較高濃度的茶多酚和咖啡堿（1 082 mg·kg-1和 301 mg·kg-1），已大于咖啡堿的 LD50，同時也較為接近茶多酚LD50的一半。已有研究認(rèn)為，過高濃度的咖啡堿能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能造成損傷[15]。由此可以進(jìn)一步推斷小鼠死亡的原因可能與過高濃度的咖啡堿甚至茶多酚引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)。六堡茶亞急性毒性實驗期間各組動物飲食、排泄、活動均正常，未觀察到中毒表現(xiàn)。六堡茶各劑量組動物體質(zhì)量、血液學(xué)、血液生化指標(biāo)以及臟器指數(shù)較對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），主要臟器在外觀形態(tài)上未發(fā)現(xiàn)有明顯病理變化。這些結(jié)果表明，六堡茶對大鼠的生長發(fā)育無不良影響，對動物的造血功能、肝腎功能、器官組織均無明顯毒性。但是六堡茶的灌胃能一定程度地降低大鼠體質(zhì)量以及血清TG和TC含量，也一定程度地驗證了它可能具有降脂減肥的功效[16-17]，但仍然需要后續(xù)進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

因此，從急性和亞急性毒理學(xué)角度看，廣西六堡茶的飲用安全性是非常高的，正常飲用六堡茶對人類身體并無有害影響，但任何東西的使用都應(yīng)該在一個合理的范圍，超出了這個范圍就不可能發(fā)揮好的作用甚至引起副作用。本研究為六堡茶的安全性評價提供了科學(xué)依據(jù)，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1]龍志榮, 馬士成, 梅宇, 等. 六堡茶產(chǎn)業(yè)市場形勢分析報告[J]. 廣東茶業(yè), 2013(3): 23-27.

[2]劉勤晉, 陳文品, 白文祥, 等. 普洱茶急性毒性安全性評價研究報告[J]. 茶葉科學(xué), 2003, 23(2): 141-145.

[3]馬偉光, 黃之鐠, 游文龍, 等. 配方普洱茶的急性毒性研究[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(1): 9-12.

[4]龔加順, 陳文品, 周紅杰, 等. 云南普洱茶特征成分的功能與毒理學(xué)評價[J]. 茶葉科學(xué), 2007, 27(3): 201-210.

[5]肖文軍, 傅冬和, 任國譜, 等. 茯茶毒理學(xué)試驗報告[J].茶葉科學(xué), 2007, 27(4): 307-310.

[6]劉子音, 王遠(yuǎn)亮, 許愛清. “金花” 菌食品安全性毒理學(xué)評價[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊, 2011(7): 29-32.

[7]覃良, 黃宇聲, 劉冠萍. 六堡茶毒性研究[J]. 中國民族民間醫(yī)藥雜志, 2013(3): 39-40.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部. 保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[Z]. 衛(wèi)法監(jiān)發(fā) [2003]42號. 2003.

[9]陳仁惇. 營養(yǎng)保健食品[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社, 2006.

[10]徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實驗方法學(xué)[M]. 2版. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 1991.

[11]紀(jì)云晶. 實用毒理學(xué)手冊[M]. 北京: 中國環(huán)境科學(xué)出版社, 1991.

[12]袁伯俊, 王治喬. 新藥臨床前安全性評價與實踐[M]. 北京: 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 1997.

[13]陸益, 楊帆, 梁寧生, 等. 茶多酚毒理學(xué)實驗研究[J]. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2005, 22(6): 831-834.

[14]陳亮延, 吳永方. 茶色素毒理學(xué)研究[J]. 武漢職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 1996, 24(4): 25-27.

[15]黃旭, 李晨曦, 汪越, 等. 咖啡因?qū)Υ笫蠛ｑR神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展, 2014(1): 5-8.

[16]張栩顏, 黃宇聲, 劉冠萍, 等. 六堡茶對高脂血癥小鼠血脂及脂質(zhì)過氧化的影響[J]. 醫(yī)學(xué)理論與實踐, 2013, 26(5): 563-564.

[17]黃宇聲, 張栩顏, 劉冠萍, 等. 六堡茶降脂作用試驗研究[J]. 中國保健營養(yǎng): 下半月, 2013(3): 875-876.

Research on Acute and Subacute Toxicity Evaluation of Liupao Tea

WU Wenliang1,2,3,6, LIN Yong1,2,3*, LIU Zhonghua1,2,3, HUANG Jian'an1,2,3, LONG Zhirong4,5, TENG Cuiqing4,5, MA Shicheng4,5, QIU Ruijin4,5, CAO Zhonghuan4,5

1. Key Lab of Tea Science of Education Ministry, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China; 4. Wuzhou Academy of Liupao Tea, Wuzhou 543003, China; 5. Wuzhou Institute of Agricultural Sciences, Wuzhou 543003, China; 6. Tea of Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences , Changsha 410125, China

Liupao tea has a long history and is characterized as famous agricultural products of Guangxi, but the study of its safety is not enough. In order to verify the safety, the main physicochemical components of Liupao tea from Wuzhou were measured by conventional test method of national standard, then, the acute and subacute toxicities of Liupao tea were systemically studied in accordance with the procedures for toxicological assessment on food safety. The experimental results showed that, the physicochemical indexes of Liupao tea were repeatable, whichwere followed with Guangxi local standards in the acute toxicity test. Using bliss method, the calculated median lethal dose (LD50) of Liupao tea was 9.38 g·kg-1with 95% confidence interval (8.43～10.44 g·kg-1), which was higher than acute toxicity criteria (5 g·kg-1). In the subacute study, compared with the control group, no death or clinical signs, or abnormally hematological, biochemical and histopathological changes were found in either groups of rats receiving daily oral gavage of Liupao tea. The three dose treatments were 0.47, 0.94 and 1.88 g·kg-1·d-1for 30 days (P＞0.05). Thus, Liupao tea products belong to the actual non-toxic grade and fulfill the requirements of food safety according to the food toxicology standards.

Liupao tea, acute toxicity, subacute toxicity, median lethal dosage

TS272.5+4；R285.5

A

1000-369X（2017）02-173-09

2017-01-11

2017-02-26

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科學(xué)基金項目（15QN22）、梧州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（201402214、201501028）、2015年梧州市六堡茶產(chǎn)業(yè)化項目、國家自然科學(xué)基金項目（31100502）

吳文亮，男，在讀博士研究生，主要從事茶葉加工及茶葉功能成分化學(xué)研究。*通訊作者：ly2005306@163.com