軟骨細胞在機械力刺激下細胞骨架及細胞形態改變的體外研究

王雪冰　宋玉娟　鄧雪峰　宋錦旗

[摘要]目的探討周期性的機械應力對大鼠的關節軟骨細胞的形態與骨架的刺激作用，為軟骨細胞的內力學信號傳導機制的臨床研究提供參考。方法將體外培養傳代至第三代的大鼠軟骨細胞置于四點彎曲加力裝置周期性機械應力體系中（4000u strain）培養30min，連續3d。對照組靜態培養。3d后檢測細胞基質合成情況以及微管、微絲、中間纖維的免疫熒光染色，用Western Blot及RT-PCR方法測量cofilin蛋白基因含量。結果加載應力組軟骨細胞氨基多聚糖和蛋白多糖的合成與對照組無明顯差異（P>0.05）；但細胞微管、微絲及中間纖維發生重排，細胞形態和取向趨于一致。實驗組cofilin蛋白含量明顯高于對照組（P<0.05）。結論周期性機械應力改變軟骨細胞的形態和細胞骨架，cofilin蛋白在軟骨細胞內力學一生物學信號轉導中發揮著重要作用。

[關鍵詞]軟骨細胞；細胞骨架；細胞形態

關節軟骨處在一個具有壓應力、張應力、流體剪切力等機械應力作用的復雜力學環境中，而機械應力在調節關節軟骨細胞生物學行為中具有十分重要的作用，能夠對軟骨細胞新陳代謝進行調控，是保證軟骨基質正常狀態的必要條件。可調控軟骨細胞的新陳代謝，是維持正常軟骨基質必不可少的條件。關節軟骨組織缺乏血液供應、細胞代謝緩慢、自我修復能力較差，即使較小的軟骨損傷也會引起嚴重的后果。我們的前期動物實驗表明，中等強度的炮臺運動能促進大鼠軟骨缺損的修復重塑，但其作用機制尚不清楚。

本研究擬通過體外實驗對大鼠關節軟骨加載周期性壓應力，觀察應力下的軟骨細胞形態和細胞骨架的變化，為軟骨細胞內力一生物信號轉化研究提供基礎，為適度應力促進關節軟骨缺損修復重塑的機制研究提供依據。

1.資料與方法

1.1一般資料

主要包括大鼠來源及所用試劑的來源。本研究中所用大鼠為7d齡，且身體健康，均由南方醫科大學實驗動物中心提供。主要試劑：鼠抗人Tubulin B單克隆抗體（北京中杉金橋生物進口分裝）；Dulbecco改良DMEM/Ham F12混合培養基（HyClone公司）；0.01mol/L磷酸緩沖液PBS（博士德公司）；碘化丙啶（Salarbio公司）；鏈菌蛋白酶（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；番紅（Salarbio公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；雙乙酸熒光素（Salarbio公司）；甲苯胺藍（Salarbio公司）；4%多聚甲醛（Salarbio公司）；II型膠原酶（Gibco公司）；山羊抗小鼠IgG/FITC標記（北京中杉金橋生物進口分裝）；I型膠原蛋白裱襯的6孔培養板（Flexercell公司）。

1.2儀器設備

主要包括四點彎曲加力裝置（四川大學華西口腔醫學院研制）；流式細胞儀（Coulter，美國）；CO2培養箱（ShelLab，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus，日本）；數碼相機（Olympus，日本）。

1.3實驗方法

主要包括細胞培養、染色以及檢測。

1.3.1軟骨細胞的分離培養及應力加載 體外分離大鼠四肢的關節軟骨并進行傳代培養，細胞培養傳至第3代，隨機分為對照組（A組）和周期性機械應力組（B組）。A組：在正常條件下培養軟骨細胞；B組：軟骨細胞置于周期性機械應力體系中（4000u strain）培養30min，連續3d。加載應力組細胞卸載后與對照組細胞同時進行以下檢測。

1.3.2番紅及甲苯胺藍染色 軟骨細胞生長于柔性的硅膠膜上，選擇PBS進行沖洗，并加入0.25%番紅以及1%甲苯胺藍染液，在室溫條件下，進行孵育2h。隨后利用顯微鏡進行觀察拍照。番紅染色可以明確氨基葡聚糖合成情況；甲苯胺藍染色可以明確蛋白多糖合成情況。

1.3.3免疫熒光檢測 當細胞的80%貼合于蓋玻片后，在超凈的工作臺上放置一24孔的培養板，并取出貼有細胞的蓋玻片，使用PBS液進行2次清洗，后加入2%的甲醛溶液，進行固定。固定后，使用0.5%的Triton液清洗細胞3次，每次10min。加一抗（sigma公司），在37℃條件下，靜置1h。將蓋玻片置于24孔板上，使用0.5%Triton液進行3次清洗，每次10min。后加如異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）標記的二抗（sigma公司），37℃條件下，靜置1h。將蓋玻片置于24孔板，0.5%Triton液進行3次清洗，每次10min。將所有蓋玻片放置于24孔板中，使用0.5%Triton液進行3次清洗，每次10min，后將清洗液棄去，加入4，6-二脒基2-苯基吲哚（4，6diamidino2-phenylindole，DAPI）進行染核，在室溫條件下，進行5min。后在長方形的載玻片上低落封片劑，蓋上蓋玻片，并在室溫條件下5min封片。用LCSM（LeicaSPS Germany）觀察并記錄圖像。

1.3.4 RT-PCR檢測cofilin基因表達 以TrizolRNA試劑盒提取細胞總RNA，依據GenBank上登陸cofilin基因序列，以B-actin作為內參照，設計引物序列。cofilin正義引物：TGTGGCTGTCTCTGATGGAG，反義引物：3TGTCTGGCAGGATC 3TGAC：B-acfin正義引物：CAC GTA CGT TGC TAT CCAGGC，反義引物：CTC CqT AAT GTC ACG CAC GAT。PCR條件95℃變性4min：95℃變性45s：53℃復性45s：72℃延伸90s：72℃溫育10min：4℃保存24h。擴增結束后取最終產物10 u L，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含EBO.5ug/mL）。15mA、90V穩壓45min，采用kodak電泳凝膠觀察系統EDASl20掃描，分析結果。

1.3.5Western印跡檢測cofilin蛋白表達 選擇實驗組與對照組中貼壁生長的軟骨細胞懸浮液，并進行蛋白樣品提取，以pierce公司生產的BCA蛋白定量檢測試劑盒說明為標準稀釋樣品，進行蛋白濃度的檢測，并選擇5mg/mL的BSA液體將蛋白質標準品完全溶解，置于-20℃的環境下保存。選擇取標準品用PBS 10mL，并將其稀釋為100uL，保證液體的最終濃度為0.5mol/mL。進行SDS-PAGE電泳，再完成轉膜的過程中加入一抗與二抗，并進行ECL發光。通過掃描儀進行掃描，將圖像輸入到Image J軟件中進行圖像的定量分析。

1.4統計學分析

應用SPSS15.0軟件進行統計分析。計量數據用（x±s）表示，行配對t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1軟骨細胞的形態學觀察

體外分離的大鼠關節軟骨細胞培養24h后開始貼壁，72h后能夠完全貼壁。并且大部分細胞表現為多邊形，而細胞核表現為橢圓形或者圓形，能夠清晰的觀察到1～2個核仁。進行甲苯胺藍染色后，形態學觀察可見：大部分聚集于細胞內的呈深藍色的蛋白多糖。而細胞核則被染色為深藍色或者藍紫色。進行番紅染色后，形態學觀察可見：大部分呈深紅色的氨基葡聚糖陽性物質聚集于細胞內。加載組和對照組無顯著差別，而應力組的關節軟骨細胞發生形態改變，并且其取向逐漸趨于相同。見圖1A～D。

2.2微絲的形態學觀察

實驗組軟骨細胞微絲為與細胞長軸平行的線狀均勻纖維，排列整齊，呈線狀拉伸，核深染。對照組軟骨細胞微絲形態及分布較散亂，纖維顯稀疏，與對照組比較核淡然。見圖2A～B。

2.3微管的形態學觀察

實驗組軟骨細胞邊緣平整、銳利，細胞微管呈網絡狀分布于各個細胞內以維持細胞形態，在核周可見明顯的斑點狀微管聚集區。對照組軟骨細胞微管熒光強度明顯較弱，邊緣模糊，未見明顯核周聚集區。見圖2C～D。

2.4中間纖維的形態學觀察

實驗組軟骨細胞中間纖維圍繞細胞核且從細胞核到細胞膜呈遞增的貫穿分布，呈平滑的細絲狀，成束成網，在細胞膜周圍分布密集，形成亮帶，中間纖維擴展的細胞外基質的部分呈現為亮帶外周的微弱綠色熒光。對照組軟骨細胞中間纖維排列紊亂，熒光強度普遍較弱，呈波浪狀圍繞細胞核分布，個別細胞中存在中間纖維的斑塊狀聚集，膜周亮帶較弱或無，亮帶以外微弱綠色熒光較寬。見圖2E～F。

2.5RT-PCR檢測cofihn基因表達

RT-PCR檢測顯示實驗組軟骨細胞cofilin基因表達為（1 52±0.12），對照組為（0.99±0.01），兩組相比差異具有統計學意義（t=31.123，P=0.000）。見圖3。

2.6Western蛋白印跡檢測cofifin蛋白表達

實驗組軟骨細胞中cofilin蛋白表達明顯高于對照組軟骨細胞cofilin蛋白的表達。見圖4。

3.討論

軟骨在動物全身關節活動中發揮著重要作用，其含有特殊的軟骨基質，因而能夠承受一定的機械力而不會發生永久變形。同樣，在軟骨的生長發育過程中，其形態和功能的維持及損傷后的修復也離不開力學刺激，缺乏力學刺激會導致軟骨退行性變。

軟骨細胞在機械力的傳導和轉化方面起著舉足輕重的作用。細胞形態是細胞功能的體現形式，是細增殖分化與凋亡等諸多胞內事件的參與者，同時，細胞形態與細胞所處的力學環境密不可分，是細胞內部力平衡的最直觀外在表現，因此，對軟骨細胞的形態研究，是研究機械應力影響軟骨修復機制的基礎。

本實驗中在周期性機械應力刺激下，大鼠關節軟骨細胞附壁生長良好，能夠合成有軟骨細胞生物學特點的粘多糖和氨基葡聚糖，并促進軟骨細胞的規則排列，說明在軟骨細胞的生長過程中，周期性的機械應力具有較為積極的刺激作用。臨床研究證實，外力施加載荷的頻率、時間與大小等均是影響軟骨細胞新陳代謝和生長的刺激因素。本實驗中的細胞特殊染色技術只能定性分析粘多糖及氨基葡聚糖的含量，而無法從蛋白表達的基因水平辨別蛋白合成過程中的微小差別。仍然需要更加深刻的定量分析研究，對基因和蛋白層面進行探討，進一步闡述周期性機械應力對軟骨細胞的刺激作用。

細胞骨架是維持細胞形態的重要部分，同時在維系軟骨細胞功能方面也具有十分顯著的作用。細胞骨架包括微絲、中間絲與微管是胞骨架的組成部分，聯合各種具有不同作用的調控蛋白共同構成細胞內部蛋白纖維網絡體系。細胞骨架明顯的為力學信號發生轉導提供了十分理想化和有效化的途徑。在細胞受到外界力學的刺激后，會導致細胞骨架發生重新排列，導致使細胞內應力隨之發生相應的重新分布。細胞骨架的改變不僅會造成細胞形態的變化，同時也會導致細胞力學特征及生物學特征發生變化。

微絲是真核細胞中含量最豐富的一種蛋白復合體，是細胞骨架的主要成分之一，是由肌動蛋白分子螺旋狀聚合成的纖絲，又稱肌動蛋白絲，F-actin是細胞骨架微絲蛋白的主要成分，與細胞黏附、吞噬、運動、分裂等密切相關。細胞伸出的絲狀偽足參與細胞間的通訊并使細胞具有趨化性，產生細胞形態的變化，而成束的微絲對絲狀偽足起支持作用。壓應力作用于軟骨細胞后，微絲會出現不同方向的變化，增加細胞頂-底縱向的微絲張力，但橫向微絲張力未發生變化。外界刺激到達閾值后，會破壞Actin微絲和Vimentin中間纖維聚集以及解聚的動態平衡，導致微絲發生生物學降解。應力信號通過細胞骨架網絡結構傳遞至細胞內激活相應的信號轉導通路，反饋調控，使其與組蛋白、DNA相互作用來調節復制和轉錄過程，細胞骨架發生重組，使細胞維持一定的機械強度適應機械力。

本研究中免疫熒光染色顯示應力組較對照組微絲致密且分布均勻，熒光強度增強，取向趨于一致。實驗組細胞微管呈網絡狀分布于各個細胞內以維持細胞形態，在核周可見明顯的斑點狀微管聚集區。而加載周期性機械應力后的軟骨細胞中間纖維圍繞細胞核且從細胞核到細胞膜呈遞增的貫穿分布，呈平滑的細絲狀，成束成網，在細胞膜周圍分布密集，形成亮帶。這些現象均表明周期性應力可促進軟骨細胞的骨架重排，提高其力學適應性，而細胞骨架在軟骨細胞的力學一生物學信號轉導中發揮著重要作用。

Cofilin蛋白是廣泛存在于真核細胞胞質內的一種可解聚的蛋白，研究表明其在細胞骨架動態改建過程中發揮著重要作用。本研究發現，在周期性的應力作用下，軟骨細胞內的cofilin通路的相關基因以及蛋白的表達均發生明顯的變化，這表明cofilin通路在軟骨細胞力學一生物學信號的轉導過程中具有十分重要的參與作用。同時進一步的研究應力傳導中軟骨細胞cofilin信號通路生物學相關的調控機制，有希望為明確關節軟骨的修復重塑中機械應力的作用機制提供可靠的證據。

目前有關關節軟骨細胞力一化一生物傳導的作用機制未十分明確，但臨床多項研究指出細胞骨架具有十分重要的作用。在體外施加不同程度的機械應力能夠導致關節軟骨細胞骨架重新排列，從而影響細胞增殖以及細胞外基質合成。體外施加機械應力進行培養時，關節軟骨細胞會呈現出平行排列且有順序性，同時微絲重排沿細胞的長軸進行，這能夠表明關節軟骨細胞能夠在周期性應力條件下進行優化排列，充分證明關節軟骨細胞能夠適應一定力學參數刺激下的微環境，并形成與之相適應的功能及結構特征。關節軟骨細胞是一種對力學較為敏感的細胞，能夠對機械應力做出敏感的反應，但是其信號通路的相關性研究仍然需要更深刻的探究。