水通道蛋白在小鼠小腸中的表達(dá)和定位

張 迪 , 張凱琦 , 蘇維恒 , 趙 元 , 馬 馨 , 龔 倩 , 曲桂娟 ， 馬紅霞

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118； 2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012)

水通道蛋白在小鼠小腸中的表達(dá)和定位

張 迪1, 張凱琦1, 蘇維恒2, 趙 元1, 馬 馨1, 龔 倩1, 曲桂娟1， 馬紅霞1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118； 2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012)

探明水通道蛋白在小鼠小腸中的表達(dá)及定位，為研究小腸水轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的細(xì)胞和分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。本文運(yùn)用RT-PCR和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)小鼠十二指腸、空腸和回腸中水通道蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，AQP3在小鼠空腸中存在基因和蛋白表達(dá)，AQP4在小鼠回腸中存在基因和蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步明確這兩種水通道蛋白在小腸中的表達(dá)位置，通過免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)一步證實(shí)AQP3主要表達(dá)在小鼠空腸黏膜上皮細(xì)胞，而AQP4主要表達(dá)在小鼠回腸隱窩細(xì)胞基底膜。

水通道蛋白 ； 小腸 ； 小鼠 ； 水轉(zhuǎn)運(yùn)

腸道是機(jī)體重要的水鹽代謝器官，人體每天大約有9 L液體進(jìn)入到消化道中，其中2 L來(lái)自日常飲食，另外7 L則來(lái)自于唾液腺、胃腺、胰腺、小腸腺以及肝細(xì)胞分泌的膽汁等消化液。這9 L液體84%被小腸吸收，16%被結(jié)腸吸收，僅有100～200 mL的水隨著糞便排出體外[1]。由此可見，小腸對(duì)水的轉(zhuǎn)運(yùn)在維持機(jī)體水鹽平衡中發(fā)揮著重要作用。而水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是廣泛存在于原核和真核細(xì)胞膜上快速轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異性孔道蛋白,在機(jī)體許多器官的體液轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用[2]。以往對(duì)腸道中水通道蛋白的研究主要集中在人和大鼠的結(jié)腸[3-4]，而對(duì)小鼠小腸中水通道的表達(dá)和功能研究卻確鮮有報(bào)道。本文通過RT-PCR、免疫印跡和免疫組織化學(xué)等方法，明確了小鼠小腸水通道蛋白的表達(dá)類型及表達(dá)位置，為進(jìn)一步揭示水通道蛋白在小腸水轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 成年雄性昆明系小鼠，平均體重20g±3g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK2007-0003)。總RNA提取試劑盒，購(gòu)自于TaKaRa公司；SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Taq酶，購(gòu)自Invitrogen公司；兔抗小鼠AQP3和AQP4抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(HRP-Goat Anti-rabbit IgG)，購(gòu)自Sigma公司；免疫組化試劑盒，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 分別取小鼠十二指腸、空腸、回腸各段組織，用高速勻漿器進(jìn)行勻漿，按照TaKaRa公司Total RNA提取試劑盒提取總RNA。1%非變性瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)溴化乙錠染色，凝膠成相儀掃描后觀察結(jié)果，根據(jù)28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA的亮度評(píng)價(jià)RNA是否有降解。測(cè)量其OD值并記錄RNA濃度。用Invitrogen的SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.2.2 RT-PCR 根據(jù)GenBank中公布的小鼠AQPs基因序列，選擇其保守區(qū)利用Peimer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。其特異性引物用Invitrogen的SuperScriptTMII試劑盒，按說明書提供的方法進(jìn)行總RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。以此cDNA為模板，用小鼠AQPs特異性引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物約為300 bp～500 bp大小的片段。反應(yīng)體系均為25 μL，PCR 擴(kuò)增條件如下:94 ℃ 預(yù)變性5 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃延伸50 s,35個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后在72 ℃反應(yīng)10 min，RT-PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗(yàn)。

1.2.3 Western Blot 分別取小鼠十二指腸、空腸、回腸組織放入勻漿器中，加入1.5 mL蛋白裂解液，置冰上玻璃勻漿10 min，12 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清，超聲6次(5 s/次，間隔冷卻10 s)，再以12 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?2%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TTBS (20 mmol/L Tirs, pH值7.6,0.2 mol/L NaCl,0.1% Tween-20)50 mL室溫封閉膜1 h，再用TTBS洗膜3次，每次10 min。然后加入一抗(分別為兔抗鼠AQP3抗體1∶1 000，兔抗鼠AQP4抗體1∶1 000，兔抗鼠β-actin 抗體1∶500)，4 ℃下孵育過夜。用TTBS緩沖液洗膜3次，每次10 min。以HRP標(biāo)記二抗(羊抗兔1∶5 000)室溫下孵育1 h，洗滌條件同上。雜交膜用ECL化學(xué)發(fā)光試劑于暗室中顯影并感光膠片。

1.2.4 免疫組織化學(xué) 4%多聚甲醛灌注小鼠，取小鼠空腸和回腸各約2 cm，繼續(xù)用4%多聚甲醛固定標(biāo)本24 h，石蠟包埋，6 μm連續(xù)切片。經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇再水化后，置入10 mmol/L 檸檬酸緩沖液(pH值6.0)微波修復(fù)抗原5 min，室溫冷卻，PBS漂洗。10%非免疫羊血清封閉2 h，分別用兔抗小鼠AQP3(1∶500稀釋)、AQP4抗體(1∶500稀釋)置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。多次沖洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育15 min，PBS漂洗3次，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)量分析 如圖1所示，分別從小鼠十二指腸、空腸和回腸組織中提取總RNA，用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示，28S、18S和5S三條泳帶均清晰、完整，且其亮度比基本符合2∶1，表明所提取的RNA未降解。測(cè)定并計(jì)算260 nm和280 nm紫外光吸收值OD260/OD280=1.9，表明提取的RNA純度較高，質(zhì)量可靠，可用于進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)。

圖1 總RNA凝膠電泳圖

a:十二指腸； b：空腸； c：回腸

2.2 RT-PCR 檢測(cè)小鼠小腸各段AQPs基因的表達(dá)

應(yīng)用小鼠AQPs特異性引物對(duì)十二指腸、空腸和回腸組織進(jìn)行 RT-PCR分析，以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果如圖2所示，小鼠的空腸段存在AQP3基因表達(dá)，小鼠的回腸段存在AQP4基因表達(dá)。而小鼠的十二指腸段,沒有檢測(cè)到水通道蛋白基因的表達(dá)。

圖2 RT-PCR檢測(cè) AQPs基因在小鼠十二指腸、空腸、回腸中的表達(dá)

M：DL-2 000 Marker； A：β-actin為內(nèi)參；O：AQPO; 1:AQP1; 2:AQP2; 3:AQP3; 4:AQP4; 5:AQP5; 6:AQP6; 7:AQP7; 8:AQP8; 9:AQP9; 10:AQP10; 11:AQP11; 12:AQP12

2.3 Western Blot檢測(cè)水通道蛋白AQP3和AQP4的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果表明，AQP3和AQP4基因分別在小鼠空腸和回腸中表達(dá)。為進(jìn)一步明確這AQP3和AQP4在蛋白水平的表達(dá)情況，我們應(yīng)用Western Blot方法分別檢測(cè)了AQP3和AQP4在十二指腸、空腸和回腸中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，空腸中存在AQP3的蛋白表達(dá)，而回腸中存在AQP4的蛋白表達(dá)，這與之前RT-PCR的結(jié)果一致。

圖3 Western Blot 檢測(cè)AQP3和AQP4蛋白在小鼠十二指腸、空腸、回腸中的表達(dá)

2.4 AQP3和AQP4在小鼠小腸中的定位 通過Western Blot檢測(cè)已知，AQP3在小鼠空腸中存在蛋白表達(dá)，AQP4在小鼠回腸中存在蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步確定其表達(dá)的位置，我們進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果如圖4所示，AQP3蛋白主要表達(dá)于小鼠空腸黏膜上皮細(xì)胞(圖4.A)，而AQP4蛋白主要表達(dá)于小鼠回腸隱窩細(xì)胞基底膜(圖4.B)。

圖4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)水通道蛋白在小鼠小腸的表達(dá)分布(100x)

3 討論

小腸對(duì)水的轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過兩種途徑：第一種為旁細(xì)胞途徑，即水是通過細(xì)胞的緊密連接，進(jìn)入細(xì)胞間隙，然后再轉(zhuǎn)入血液；另外一種為跨細(xì)胞途徑,即水通過絨毛柱狀上皮細(xì)胞的腔膜面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，再通過細(xì)胞基底膜或側(cè)面膜進(jìn)入血液[5-6]。這兩種途徑不是完全孤立的，是相互聯(lián)系、互為補(bǔ)充的。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，消化道對(duì)水的轉(zhuǎn)運(yùn)主要是通過旁細(xì)胞途徑完成的，即使是通過旁細(xì)胞途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，水也必須通過小腸上皮細(xì)胞的基底膜和毛細(xì)血管膜才能進(jìn)入到血液中[7-8]。因此,水的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)是影響小腸水轉(zhuǎn)運(yùn)功能的關(guān)鍵,而水通道蛋白在水的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要作用。

以往對(duì)于水通道蛋白在小腸上的表達(dá)及功能研究主要集中在人和大鼠，而對(duì)其在小鼠小腸中的表達(dá)和功能研究卻鮮有研究。我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，AQP3主要表達(dá)于小鼠空腸黏膜上皮細(xì)胞，而黏膜上皮細(xì)胞的主要功能是吸收被分解的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(包括水的吸收)，也稱吸收細(xì)胞。2003年Tomoyuki 等人將大鼠的大部分小腸切除，僅保留部分空腸和結(jié)腸，手術(shù)7 d后檢測(cè)剩余部分小腸水通道的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AQP3的表達(dá)量明顯升高[9]。2011年Nobutomo等人報(bào)道，在MgSO4引起的滲透性腹瀉大鼠模型腸道上皮細(xì)胞中，AQP3的表達(dá)量顯著增加。其原因主要是因?yàn)楫?dāng)腸道內(nèi)容物滲透壓升高時(shí)，降低腸道上皮細(xì)胞對(duì)水的吸收量，機(jī)體會(huì)代償性的引起水通道表達(dá)的增加，以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)水的吸收功能[10]。2013年Zhao等人證實(shí)，三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的炎癥因子使得小腸上皮細(xì)胞AQP3的表達(dá)量下降，從而降低了小腸對(duì)水的吸收能力，引起腹瀉[11]。由此可見，AQP3表達(dá)在小鼠空腸黏膜上皮細(xì)胞中，可能主要與空腸對(duì)水的吸收有關(guān)。

2002年Hamabata等人用人小腸 AQP4 轉(zhuǎn)染非洲爪蟾卵母細(xì)胞,然后用霍亂毒素(CT)處理這些細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其 AQP4表達(dá)明顯上調(diào),對(duì)水的通透性增加了85 %左右,這說明 AQP4 可能是CT引起分泌性腹瀉時(shí)作用的靶蛋白[12]。2014年Jiang等人在豚鼠胃壁細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了AQP4的表達(dá)，而壁細(xì)胞的主要功能就是分泌胃酸，因此他們推測(cè)AQP4的表達(dá)可能與壁細(xì)胞的分泌功能有關(guān)[13]。我們的試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，AQP4主要表達(dá)在小鼠回腸隱窩細(xì)胞中，而隱窩細(xì)胞主要是執(zhí)行腺體的分泌功能，又稱分泌細(xì)胞。由此我們推測(cè)，AQP4在回腸中的表達(dá)可能與小腸隱窩的分泌功能有關(guān)，但其具體功能還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，小腸是機(jī)體中僅次于腎臟的第二大液體轉(zhuǎn)運(yùn)器官，在維持機(jī)體水鹽平衡中發(fā)揮著重要作用，而水通道蛋白在機(jī)體的液體轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著不可替代的作用。我們的研究進(jìn)一步明確了小鼠小腸各段水通道蛋白的表達(dá)及分布情況，為揭示小腸水轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，也為小腸水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙相關(guān)疾病(如腹瀉等)的治療提供了新的藥物靶點(diǎn)。

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Expression and Localization ofAquaporins in small intestine of mice

ZHANG Di1, ZHANG Kai-qi1, SU Wei-heng2, ZHAO Yuan1, MA Xin1, GONG Qian1, QU Gui-juan1, MA Hong-xia1

(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China； 2.School of Life Science, Jilin University, Changchun 130012,China)

The aim of this study is to ascertain the expression and localization of Aquaporins(AQPs) in small intestine of mice, and provide information for the functional studies of water transport in small intestine. The expression of AQP3 and AQP4 was detected by reverse transcription PCR(RT-PCR) and Western Blot analysis. The results indicated that the expression of AQP3 was detected in jejunum, and the expression of AQP4 was detected in ileum. The expression of AQP3 was located in intestinal epithelial cells, and AQP4 was located in intestinal crypt cells by immunohistochemistry.

Aquaporin (AQP)； Small intestine； Mice； Water transport Corresponding author：MA Hong-xia

2016-08-01

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31402205)

張迪 (1980-)，男，講師，博士，從事細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能方面的研究，E-mail：zhangdi@jlau.edu.cn

馬紅霞，E-mail:hongxia0731001@163.com

S852

A

0529-6005(2017)03-0105-03