HPLC法測定白龍散中龍膽苦苷和小檗堿的含量

包愛情 ， 朱聰英 ， 陸春波 ， 林仙軍

(浙江省獸藥飼料監察所， 浙江杭州311101)

HPLC法測定白龍散中龍膽苦苷和小檗堿的含量

包愛情 ， 朱聰英 ， 陸春波 ， 林仙軍

(浙江省獸藥飼料監察所， 浙江杭州311101)

建立反向高效液相色譜法檢測白龍散中龍膽苦苷和小檗堿含量的方法。試驗采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ，以0.5%三乙胺水溶液(用85%磷酸調pH值至3.0)-甲醇(60:40，v:v)為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；檢測波長為270 nm；龍膽苦苷和小檗堿的含量測定范圍分別為4.09～102.2 μg/mL(R=0.999 7)，3.93～98.26 μg/mL(R=1.000 0)；加樣平均回收率分別為 98.63%，97.78%；RSD分別為0.96%，1.23%；該方法方便、準確、可靠，適用于測定白龍散中龍膽苦苷和小檗堿的含量。

白龍散； 高效液相色譜； 龍膽苦苷； 小檗堿

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，配Waters 2996二極管陣列檢測器，美國Waters公司； XS-205電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇為色譜純，Merck 公司；其余試劑均為分析純；試驗用水為milli-Q 超純水。龍膽苦苷對照品(來源：中國獸醫藥品監察所，批號：Z0250510，含量：100.0%)；鹽酸小檗堿對照品(來源：中國獸醫藥品監察所，批號：110713—200911，含量：按小檗堿計為86.8%)。白龍散供試品(批號分別為20160101，20160102，20160103)，由浙江某廠生產；自制樣品：中藥飲片，購自上藥凱侖醫藥股份有限公司；經浙江省獸藥飼料監察所鑒定，按相應處方自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18XDB(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.5%三乙胺水溶液(用85%磷酸調pH值至3.0)-甲醇(60∶40)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：270 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取龍膽苦苷對照品10.22 mg和鹽酸小檗堿對照品11.32 mg，置同一100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液(約為100 μg/mL)。精密量取20 mL混合對照品貯備液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。

2.2.2 供試品溶液 取白龍散0.1 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加甲醇50 mL，稱重，回流1 h，冷卻至室溫，用甲醇補足重量，過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例分別自制不含龍膽和黃連的散劑，按其工藝制成相應的陰性對照樣品，再按2.2.2方法制備成陰性對照溶液。

數據是計算機網絡的重要組成部分，也是計算機網絡的核心元素。在計算機網絡運行的過程當中，數據會產生諸多漏洞，而不法分子則會利用這些數據漏洞來攻擊計算機，致使計算機網絡產生安全風險。如存在于計算機網絡運行過程中的節點數據，其就極易遭到攻擊，數據信息被竊取、篡改的現象時有發生，致數據完整性遭到破壞。部分不法分子還會在數據脆弱部分對其進行攻擊，通過攻擊此部分內容來窺探內網的數據信息，致內網數據遭到泄漏。此外，利用數據漏洞還可給計算機網絡植入木馬、病毒等，致系統癱瘓，無法運行。

2.3 系統適應性試驗 分別取混合對照品溶液貯備液、混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液注入液相色譜儀，進行全波長掃描，記錄龍膽苦苷和小檗堿的光譜圖(圖1～圖2)；同時記錄混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液的色譜圖(圖3～圖6)。該色譜條件下，龍膽苦苷和小檗堿分離度良好，與其他峰分離良好，理論塔板數均大于3 000。陰性樣品在混合對照品色譜圖相應的位置上無吸收峰，表明處方中的其他成分對測定結果并無干擾，滿足定量檢測需要。注：圖中峰1：龍膽苦苷；峰2：小檗堿。

圖1 龍膽苦苷光譜圖

圖2 小檗堿光譜圖

圖3 混合對照品270 nm色譜圖

圖4 樣品270 nm色譜圖

圖5 自制陰性樣品(缺龍膽)270 nm色譜圖

圖6 自制陰性樣品(缺小檗堿)270 nm色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍 精密量取混合對照品貯備液(約100 μg/mL)適量，分別用甲醇稀釋成約40、20、10、10、4 μg/mL系列溶液，分別精密量取上述混合對照品貯備液及相應稀釋的溶液10 μL，按上述色譜條件，記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積積分值(Y)對濃度(X，μg/mL)進行線性回歸計算，方程為：

龍膽苦苷： Y=6219.4X-1868.8(R=0.999 7)，線性范圍4.09～102.2 μg/mL;

小檗堿： Y=40,370.3X-16,246.4(R=1.000 0)，線性范圍3.93～98.26 μg/mL。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL,按上述色譜條件，連續重復進樣6次記錄峰面積，計算結果，龍膽苦苷和小檗堿峰面積的RSD分別為0.28%，0.32%。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液(批號：20160101)，分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h進樣10 μL，記錄色譜峰面積，計算龍膽苦苷和小檗堿的峰面積的RSD分別為1.01%、1.07%。結果表明，供試品溶液在室溫下放置24 h穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一批供試品(批號：20160101)，分別稱取6份，照2.2.2項下方法制備供試品溶液，測定供試品溶液中龍膽苦苷和小檗堿的含量。結果測得龍膽苦苷的含量分別為25.86、25.72、25.70、25.93、25.49、25.74 mg/g；小檗堿的含量分別為8.44、8.76、8.66、8.56、8.52、8.69 mg/g；RSD分別為0.57%、1.38%。結果表明，此方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知龍膽苦苷和小檗堿含量的樣品(批號：20160101) 0.05 g，共6份，置100 mL圓底燒瓶中，精密加對照品溶液(稱取龍膽苦苷對照品13.26 mg和鹽酸小檗堿對照品5.02 mg于同一500 mL容量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度)50 mL，其余按2.2.2項同法處理后，測定并計算回收率，結果見表1。

表1 白龍散回收率試驗結果 (n=6)

2.5 樣品測定 取不同批號的白龍散，按2.2.2項下方法處理，按上述色譜條件進行測定，計算樣品中龍膽苦苷和小檗堿的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果 (mg/g)n=3

3 討論與小結

3.1 試驗條件的優化

3.1.1 波長的優化 在波長選擇上，通過二極管陣列檢測器(PDA)在200 nm～400 nm進行了全掃描，結果顯示，龍膽苦苷在275 nm的波長處有最大吸收，小檗堿在228、265、347 nm的波長處有較大吸收波長，在270 nm的波長處，兩者均有較大的吸收，因此本文將檢測波長定為270 nm。

3.1.2 提取方式的優化 在提取方式選擇上，比較了浸漬、超聲和回流的提取效果，研究表明，對龍膽苦苷的提取上浸漬沒有超聲和回流效果好，但超聲和回流沒有差異；但在小檗堿的提取上回流要優于超聲，超聲又要明顯優于浸漬，因此為了更好地提取本文選擇回流作為提取方式。

3.1.3 提取時間的優化 在提取時間的選擇上，比較了30 min，60 min和90 min的提取效果，研究表明，對于龍膽苦苷3種時間無顯著差異，而對于小檗堿30 min的提取效果要顯著低于60 min和90 min，而60 min和90 min的提取效果相當，因此本試驗將提取時間定為60 min。

3.2 小結 本試驗參考文獻[5-6]選用不同的比例的甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸為流動相進行梯度洗脫，結果表明，選用當前試驗的流動相時，樣品中龍膽苦苷和小檗堿分離效果好、無雜峰干擾且時間短。目前尚未見到白龍散組分含量測定相關文獻報道，文獻報道[7-8]小檗堿含量測定的方法普遍在流動相配制中使用了十二烷基磺酸鈉，而十二烷基磺酸鈉對C18柱有一定的破壞性，本試驗使用的流動相對柱子傷害較小。本試驗開發的方法單針分析時間短，前處理簡便，方法簡便可靠，可用于大批量樣品檢測進行，可為白龍散質量控制提供參考。

[3] Lei Zhaoa, Juan Yea, Guo-tai Wu,etal. Gentiopicroside prevents interleukin-1 beta induced inflammation response in rat articular chondrocyte [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2015,172: 100-107.

[4] Guo-xun Lia, Xi-mo Wanga, Tao Jiang,etal. Berberine prevents damage to the intestinal mucosal barrier during early phase of sepsis in rat through mechanisms independent of the NOD-like receptors signaling pathway [J]. European Journal of Pharmacology, 2014,730: 1-7.

[5] 王文月，劉志宏，黃愛文，等. 雙波長HPLC法測定酸性龍膽合劑中龍膽苦苷和橙皮苷的含量[J]. 中國藥房, 2015,26(9):1241-1243.

[6] 陳靜，支張， 索朗次仁，等. HPLC法測定藏藥解吉那保不同部位龍膽苦苷的含量[J]. 現代中醫藥, 2015, 35(6): 92-94.

[7] 熊巨良. 高效液相色譜法測定五味黃連丸中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的含量[J]. 湖南中醫雜志, 2014, 30(9): 152-154.

[8] 王慧，毛春芹， 周淵，等. HPLC同時測定舒樂洗劑中苦參堿和小檗堿[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2014, 20(9):88-90.

Determination of Gentiopicroside and Berberine in Bailong San by HPLC

BAO Ai-qing , ZHU Cong-ying , LU Chun-bo ， LIN Xian-jun

(Zhejiang Province Institute of Veterinary Drug and Feedstuff, Hangzhou 311101，China)

To establish a HPLC method for the determination of gentiopicroside and berberine in Bailong San, analysis was performed on a C18 column (250 mm×4.6 mm，5 μm)with a mobile phase of 0.5% triethylamine in water(pH was adjusted to 3.0 by 85% phosphoric acid)-methanol (60:40，v:v)at a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30℃. The injection volume was 10 μL and the determination wave length was 270 nm. The linear range was 4.09～102.2 mg/mL(r=1.000 0) and 3.93～98.26 mg/mL (r=1.000 0), and the average recovery was 98.63% and 97.78% with RSD% of .96% and 1.23%, respectively. This method was convenient, accurate and reliable for the determination of gentiopicroside and berberine in Bailong San .

Bailong San; HPLC; Gentiopicroside; Berberine

2016-08-05

包愛情(1989—)，男，碩士，從事獸藥檢測、畜產品獸藥殘留檢測工作，E-mail：baoaiqing@126.com

R286

A

0529-6005(2017)03-0096-03