豬捷申病毒的分離鑒定及其VP1基因的序列分析

郭容利 ， 李 彬 ， 溫立斌 ， 范寶超 ， 何孔旺

(江蘇省農業科學院獸醫研究所農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室國家獸用生物制品工程技術研究中心 ， 江蘇南京210014)

豬捷申病毒的分離鑒定及其VP1基因的序列分析

郭容利 ， 李 彬 ， 溫立斌 ， 范寶超 ， 何孔旺

(江蘇省農業科學院獸醫研究所農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室國家獸用生物制品工程技術研究中心 ， 江蘇南京210014)

應用 PK 細胞，從臨床癥狀上表現為腹瀉的仔豬腸內容物中分離到一株病毒，對該病毒進行RT-PCR檢測,證明該病毒為豬捷申病毒(PTV)，命名為PTVJS2013。對該病毒進行細胞半數感染量(TCID50)測定,動物試驗以及VP1蛋白基因序列測定，并與國內外16株不同血清型PTV的VP1基因序列進行了同源性比較及系統進化樹分析。 結果表明，豬捷申病毒JS2013 VP1基因核苷酸與8型血清型PTV 同源性達到 99.6%。而與其他血清型的 PTV VP1基因核苷酸的同源性僅在 58.3%～74.7%之間；與國內分離的PTV-Jilin/2003/2(JN710381/PTV-8)和PTV-Fuyu/2009(HQ020378/ PTV-8)親緣關系最近，同屬于 PTV-8血清型一個分支。

豬捷申病毒； 分離與鑒定； VP1基因； 序列分析

豬捷申病毒Porcineteschovirus(PTV)屬于小核糖核酸病毒科，豬捷申病毒屬，目前至少有11個血清型,不同血清型毒株，可引起繁殖障礙、肺炎、心肌炎和心包炎、腹瀉和腦脊髓炎等多種癥狀[1]。1929年，豬捷申病首次暴發在原捷克斯洛伐克的捷申城，發病豬主要表現為非化膿性腦脊髓炎，此次疫情造成豬群死亡率高達90%，經濟遭受嚴重損失,隨后蔓延到歐洲，在北美、澳大利亞、非洲等各地相繼出現。亞洲國家中日本對此病的報道相對較多[2]。在我國，早在2003年，哈爾濱獸醫研究所在我國內蒙古自治區首次分離到了豬捷申病毒swine/CH/IMH/03株[3]，近年來，關于PTV 流行病學調查報告顯示，在我國及周圍國家與地區大部分豬場均有感染，如韓國、泰國、臺灣等,給養豬業帶來巨大的損失。

PTV基因組為單股正鏈RNA ，長約7.2 kb，僅含有1個完整的開放閱讀框(ORF)；ORF編碼1個多聚蛋白，該產物可被蛋白水解酶裂解為結構蛋白L、VP1、VP2、VP3、VP4 和非結構蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D[4]。VP1是 PTV 的主要結構蛋白之一，在 VP1 蛋白基因組的區域中的設計的引物適用于血清型的評估,而且被廣泛的應用[5],Cano等[6]指出，對PTV VP1蛋白基因組序列的比較分析有可能是鑒別不同毒株血清型的一個方法。

本試驗應用 PK 細胞，從臨床上表現為腹瀉癥狀的仔豬腸內容物中分離獲得一株PTV，對該病毒進行空斑純化，TCID50測定與動物試驗，并設計引物對其VP1蛋白基因序列進行了擴增、克隆及序列分析, 以期為該病毒在致病、檢測及分子生物學等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 豬腎細胞(PK)，購自ATCC；TRIZol LS Reagent 為美國Invitrogen 公司產品；HSTMMix， 購自東盛公司；DNA Marker DL-2 000，購自 TaKaRa 公司；Agarose Gel DNA Purification Kit，購自 Axygen 公司。

1.2 病毒分離

1.2.1 腹瀉病料的處理 疑似病料來自上海淇淋某豬場，取臨床癥狀表現為腹瀉的仔豬腸內容物，1∶5加入PBS，用研缽研碎，凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清液， 過濾除菌，濾液置-80 ℃保存備用。

1.2.2 病毒的分離與病毒細胞半數感染量(TCID50)的測定 長滿單層的PK細胞，用Hank′s液清洗2遍，接種上述過濾除菌的病毒液，置37 ℃，5%CO2w溫箱吸附1 h后加入細胞維持液(DMEM 2%FBS GIBCO)，每日觀察，3～5 d后收獲細胞病毒混合液，凍融3次，再盲傳多代，觀察細胞病變。利用病毒蝕斑技術單層法，將病毒進行3次挑斑，最后得到單純的病毒。病毒在PK細胞連續傳代后對其進行病毒細胞半數感染量(TCID50)的測定。

1.3 RT-PCR擴增鑒定

1.3.1 引物的設計與合成 引物設計參照GenBank上登錄的PTV F65毒株(AJ011380)基因序列，利用Primer軟件設計一對引物：上游引物VP1F; 5′-CTAAAGGGACCCTCCAACAT-3′，下游引物VP1R：5′-CTCATCATAGGCTTCACAAA-3′，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.3.2 疑似病料上清液以及分離毒10代病毒RNA的提取與RT反應 參考文獻[7]。

1.3.3 PTV VP1基因的擴增與測序 PCR反應：在25 μL反應體系中，2×HSTMMix12.5 μL，引物對1μL/1μL(20 pmol.μL-1)，cDNA 2 μL，加無RNA酶的ddH2O至終體積為25 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min ；38個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物電泳，膠回收送至上海英駿生物技術有限公司進行測序。

1.4 分離株VP1基因核苷酸序列比較及系統進化分析 分離株PTV VP1基因的全基因序列，結合GenBank中有代表性的16個PTV參考毒株的VP1基因的全基因序列，應用DNAStar分析軟件CLUSTALW方法進行序列比對并繪制了VP1基因序列系統進化樹，分析各個病毒間親緣關系和VP1的基因序列的同源性。

1.5 動物試驗 取未吃初乳初生仔豬4頭，隨機分為2組隔離飼養，分離株PTV第10代口服接種2頭，接種劑量為2 mL(106.5TCID50/mL)。對照組仔豬2頭，口服接種無血清的DMEM 2 mL，觀察病毒對仔豬的致病性。

2 結果

2.1 病毒分離以及TCID50的測定 病毒液在接種PK細胞5 d后開始出現不典型病變，只是表現細胞堆積,收獲細胞病毒液，接種二代，3 d就出現病變，細胞變圓脫落，病毒繼續傳代培養，隨著代次的增加，細胞病變24 h就達到95%，細胞病變呈圓形，類似葡萄串樣聚集在一起，然后脫落(圖1)。病毒進行3次挑斑，最后得到單純的病毒，命名為PTVJS2013，目前傳代至10代，20代的TCID50分別為106.5/mL、107.0/mL。

圖1 分離株接種PK細胞24 h后細胞病變 (40×)

A：感染病毒的PK細胞； B：對照 PK 細胞

2.2 RT-PCR鑒定 PTVJS2013部分基因片段(包含完整的VPI基因片段)RT-PCR產物在1%瓊脂糖上電泳后在紫外燈下觀察，可以見到清晰的特異性條帶，在957 bp，與預期大小一致(圖2)。

圖2 PTV分離株VP1基因片段RT-PCR電泳圖

1：疑似病料； 2：分離株10代； 3：陰性對照； 4：DNA Marker DL-2 000

2.3 VP1基因系統進化樹分析 RT-PCR產物膠回收后測序結果顯示，測序的產物核苷酸為957 bp,包含全長VP1基因756 bp。PTVJS2013 VP1基因系統進化分析結果(圖3)表明，本實驗室分離的PTVJS2013株屬于PTV-8血清型 。與Jilin/2003/2(JN710381.1)、Fuyu/2009(HQ02037)兩個毒株遺傳關系最近，其VP1核苷酸的同源性達到99.6%，與國內PTV-8型分離株VP1核苷酸的同源性達到96.5%～99.6%，而與德國的PTV-8(AF296118.1)VP1核苷酸的同源性只有87.8%，PTV-8型毒株與其他血清型的毒株分屬于不同的分支，PTV JS2013株與其他血清型的毒株之間親緣關系較遠，核苷酸的同源性只有58.3%～74.7% 之間。PTV JS2013株與國內Jilin/2003/2(JN710381.1)、Fuyu/2009(HQ02037)、 HB/2010 (JQ664746.1)、Jilin/2003/1(GQ293092)及德國的1個毒株(AF296118.1)，這6個毒株同屬PTV-8型于一個分支。而與其他血清型的PTV毒株的親緣關系相對較遠。

圖3 PTVJS2013株VP1基因系統進化樹

2.4 動物試驗 攻毒組仔豬24 h后開始腹瀉，排黃色水樣稀便，沒有觀察到明顯的神經癥狀，44 h后攻毒組1頭仔豬死亡，另外1頭在52 h死亡；剖檢見腸道病變明顯，結腸腸壁變薄，腸道和腸系膜出血嚴重，腸腔內充滿黃色腥臭水樣液體。腸內容物RT-PCR檢測PTV呈陽性。對照組仔豬生長正常，腸內容物檢測為陰性。

3 討論

本實驗室在進行PEDV,TGEV流行病學調查時檢測到TGEV與PTV的混合感染，應用PK細胞，從臨床上表現為腹瀉癥狀的仔豬腸內容物中分離獲得1株PTV ，通過挑斑純化，繼續傳代，病毒滴度達到107/0.1 mL,對未吃初乳的仔豬具有很強的致病性，臨床癥狀主要表現為腹瀉，與 PEDV,TGEV對仔豬的致病時臨床癥狀表現一樣；剖檢時腸的病理變化極為相似，從肉眼上觀察，很難區分是哪種病毒的感染，因此，需借助實驗室診斷來確定病原。近些年來，對PEDV,TGEV的報道相對較多[7]，也有PTV與TGEV混合感染的報道[8]，而PTV在引起腹瀉病例中起什么樣的作用，關注甚少。王瑤[9]、Chaofan Zhan[10]等利用不同的方法對不同地區的豬捷申病進行了流行病學調查，其陽性率分別達到 60.17%，79.12% ，說明PTV感染在我國已非常普遍，嚴重威脅我國養豬業，應引起高度重視。

Cano[6]指出，對PTV VP1蛋白基因組序列的比較分析有可能是鑒別不同毒株血清型的一個方法。PTV共分為11個血清型，近年又有新的血清型PTV -12出現的報道[11]。本試驗對PTVJS2013 VP1基因系統進化分析結果顯示，分離株PTVJS2013株與Jilin/2003/2(JN710381.1)、Fuyu/2009(HQ02037)兩個毒株遺傳關系最近，其VP1核苷酸的同源性達到99.6% ，與國內另外的兩個HB/2010 (JQ664746.1)、Jilin/2003/1(GQ293092)及 德國的1個毒株(AF296118.1)，這6個毒株的同屬于PTV-8型一個分支，證明本實驗室分離的PTV JS2013株屬于PTV-8血清型。PTV-8型毒株與其他血清型的毒株分屬于不同的分支，PTV JS2013株與其他血清型的毒株之間親緣關系較遠，核苷酸的同源性只有58.3%～74.7%之間。說明PTV不同血清型毒株 VP1基因組差異性顯著。

不同的毒株在感染豬群后產生的臨床癥狀也不同，Fuyu/2009(HQ02037)與PTV JS2013 VP1核苷酸同源性為99.6%，而對豬群的致病性大有不同，PTV JS2013表現對仔豬的急性腹瀉，而PTV-Fuyu/2009(HQ02037)則變為繁殖障礙、死胎、流產等癥狀[12]；swine/CH/IMH/0(PTV-1)3接種未吃初乳的仔豬表現為腹瀉和神經癥狀[13]，因此，PTV不同血清型，以及相同血清型不同的毒株感染豬群后臨床表現的多樣性給此病的防控帶來更大的挑戰。

[1] 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所.動物傳染病學[M],北京:中國農業出版社，2008：279-281.

[2] M Yamada, R Kozakura, K Nakamura,etal. Pathological Changes in Pigs Experimentally Infected with Porcine Teschovirus [J]. J Comp Path， 2009, Vol. 141： 223e228.

[3] Feng L， Shi H Y,Liu S W,etal. Isolation and molecular characterization of a porcine teschovirus 1 isolate from Chine[J].Acta Virol ,2007,51(1):7-11.

[4] Roland Z,Simone S,Andrea S H,etal. Link-age map of protein interactions of porcine teschovirus [J],J Gen Virol,2005,86:2763-2768.

[5] La Rosa G, Muscillo M, Di Grazia A,etal.Validation of RT-PCR Assays for Molecular Characterization of Porcine Teschoviruses and Enteroviruses [J].J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health， 2006， Aug;53(6):257-265.

[6] Cnao C G, Palero F, Buitrgo M D,etal. Aanlyzing the genetic,diversity of Teschoviruses in spinsh pig population using complete VP1sequences[J]. Infect Genet Evol,2011,11(8):2144-2158.

[7] 郭容利，何孔旺，倪艷秀，等.PEDV、TGEV、PARV多重RT-PCR方法的建立及其應用 [J]，江蘇農業學報，2013，29(5):1065-1069.[8] Wang L, Ge C, Wang D,etal.The survey of porcine teschoviruses, porcine circovirus and porcine transmissible gastroenteritis virus infecting piglets in clinical specimens in China [J]. Trop Anim Health Prod，2013， Jun;45(5):1087-1091.

[9] 王瑤，田志軍，王斌，等．株豬捷申病毒的分離鑒定及血清學初步調查[J]．黑龍江畜牧獸醫，2011，2：14-17．

[10] Chaofan Zhang, Zhongtian Wang, Feng Hu,etal. The survey of porcine teschoviruses in field samples in China with a universal rapid probe real-time RT-PCR assay [J] .Trop Anim Health Prod，2013,45:1057-1061.

[11] Cano-Gómez M A. Jiménez-Clavero.Complete Coding Genome Sequence of a Putative Novel Teschovirus Serotype 12 Strain [J].Genome Announc，2016， Mar 10;4(2):107-116.

[12] Lin W, Cui S, Zell R .Phylogeny and evolution of porcine teschovirus 8 isolated from pigs in China with reproductive failure[J]. Arch Virol， 2012， Jul;157(7):1387-1391.

[13] 馮力，胡守萍，時洪艷，等．豬捷申病毒Swine/CH/lMH/O3分離株細胞適應性和致病性研究[J].中國預防獸醫學報.2012,34(7):530-533.

2016-06-01

江蘇省農業科技自主創新資金[CX(15)1056]

郭容利(1974-)，女，副研究員，碩士，主要從事動物疫病防控研究，E-mail：guorl1974@163.com

何孔旺，E-mail：kwh2003@263.com

S852.659.6

A

0529-6005(2017)03-0043-04