傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)分離株病原學研究及全基因組序列分析

焦 雪 , 吉尚雷 , 張培軍 , 冷東澤 , 茆安亭 , 李月紅

(1.吉林農業大學動物科學技術學院, 吉林長春130118; 2.吉林省衛生檢測檢驗中心, 吉林長春130118)

傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)分離株病原學研究及全基因組序列分析

焦 雪1, 吉尚雷1, 張培軍2, 冷東澤1, 茆安亭1, 李月紅1

(1.吉林農業大學動物科學技術學院, 吉林長春130118; 2.吉林省衛生檢測檢驗中心, 吉林長春130118)

為初步了解東北地區某虹鱒養殖場的一株傳染性造血器官壞死病病毒株的病原學特征，將該病毒株進行虹鱒魚苗人工回接感染試驗。結果顯示，一周內人工感染試驗魚均出現明顯的臨床癥狀。將病死虹鱒魚苗研磨過濾除菌后接種到胖頭魚肌肉細胞系(FHM)，出現了特征性病變(CPE)，用傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)4組水生動物病毒的6對特異性引物對該毒株進行race-PCR，擴增其全長。結果顯示，該病毒基因組全長為11 132 nt，基因組序列中4種核苷酸G、A、T、C含量分別為24.28%、28.67%、19.46%、27.59%。將序列與多株GenBank中已發表的IHNV毒株相應基因進行比較。結果顯示，分離株G基因與韓國株ChYa07和PcKw11同源性較高，分別為97.8%和97.5%，其進化樹分析結果顯示，CJ-13株與韓國株和日本株在遺傳進化關系上較近。

傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV) ； 流行病原學 ； 全序列

傳染性造血器官壞死病(infectious haematopoietic necrosis,IHN)可引起虹鱒魚和鮭魚全身性、致病性的急性傳染病[1]。20世紀中期，美國首先發現了IHNV，不久，歐洲地區一些臨近的國家相繼發現，20世紀70年代末，IHNV由北美洲傳到太平洋西北的日本北海道附近，1985-1995年，該病進入中國東北境內[2]。1992年，德國科學家從虹鱒魚體內分離出IHNV；2006年，劉葒[3]在患病虹鱒魚等病魚的魚卵中檢測出IHNV。

傳染性造血器官壞死病病毒為諾克拉彈狀病毒屬[4]，病毒粒子是單股負鏈線狀單鏈RNA，其基因組成部分由3′-5′端依次是前導區、結構蛋白基因區與各基因之間的連接區以及5′端不轉錄的拖尾序列。排列方式為3′-N-P-M-G-NV-L-5′。根據地理區域可分U基因型、L基因型、M基因型3種毒株，M基因組比U和L基因組的基因多樣性更高[5]。

2014年，吉林省延邊自治州部分冷水魚場的虹鱒魚苗疑似被IHNV感染患病，將部分魚苗分離到的病毒毒株進行虹鱒魚苗回歸感染試驗，以及病毒滴度測定試驗，確定IHNV為病魚死亡的主要病原，明確其致病性；并對病毒株進行全基因組測序，與IHNV其他株親緣關系進行了初步分析，確定其與其他區域病毒之間的進化關系，并將主要蛋白序列進行同源性分析，掌握該分離株的遺傳背景，旨在研究新分離毒株的傳播途徑，為中國東北地區傳染性造血器官壞死病的預防檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 病死魚取自吉林省延邊自治州青龍漁場的虹鱒魚苗，體長1.5～3.5 cm；胖頭魚肌肉細胞系(FHM)由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 M199培養基由實驗室自行保存，特級胎牛血清，購自Gibco公司；cDNA反轉錄試劑盒、膠回收純化試劑盒、EXTaqDNA、NotI、XhoI和EcoRI，購自寶生物工程(大連)有限公司；TRIZol聚合酶，購自Invitrogen公司；質粒DNA小量試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 病毒分離 取2 cm大小的虹鱒魚苗剪碎并磨成粉末，加入3 mL M199培養基于1.5 mL離心管中離心15 min(7 000 r/min 4 ℃)，吸取上清并用濾膜過濾，然后進行1∶10、1∶50、1∶100稀釋，抽取50 μL上清加入FHM單層細胞中，置于15 ℃培養1周。1.4 病毒滴度測定 病毒懸液按照10-1-10-10做10倍稀釋，接種于長滿FHM單層96孔板中。每個稀釋度進行8孔重復，15 ℃吸附1 h候加入新鮮的M199培養基15 ℃下培養。陽性對照為未稀釋的細胞毒，陰性對照為正常細胞，7 d內觀察CPE，TCID50效價計算采用Karber法，即LgTCID50=L-D(S-0.5)，L為最高稀釋度的對數，D為稀釋度對數之差，S為陽性孔比率總和。

1.5 IHNV全基因組擴增 根據GenBank中登錄的IHNV全基因組序列WRAC株(NC_001652.1)設計了6對相互重疊片段的引物，采用50 μL的PCR反應體系：cDNA產物3 μL，10×Taq酶Buffer 5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L each)2 μL，Mg2+(50mmol/L)2 μL，上下游引物(40 μmol/L)各2 μL，0.5 μLTaqDNA polymerase(invitrogen)，補ddH2O至50 μL。PCR 反應條件為：首先94 ℃預變性5 min，再94 ℃變性4 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行結果判定。3′末端測序采用RACE法，通過引物Oligo(dT)將mRNA逆轉錄為cDNA，以該cDNA為模板，以IHNV特異性引物3′RACE GSP和Oligo(dT)為引物進行PCR，擴增3′末端區的基因組。5′末端的基因組序列按照RACE試劑盒進行擴增，引物序列見表1。

表1 擴增IHNV全序列的引物

1.6 序列及同源性分析 目的片段連接載體后轉入感受態細胞，提取質粒酶切驗證，將酶切正確的菌液進行測序，每個測序的陽性質粒都設3個平行組，以保證測序結果的正確性。將獲得的DNA序列結果利用DNAStar軟件進行同源性比對，利用 MEGA5.2 分析遺傳進化關系構建系統進化樹。所參考的毒株以及登錄號為：220-90株(GQ413939.1)，carson-89株(AY442508.1)，HO-7株(AY442512.1)，HV7601株(AB231658.1)，LWS-87株(AY442515.1)，RB-76株(AY442516.1)，SRCV株(AY442517.1)，WRAC株(AY442518.1。1.7 動物回歸試驗 選取體重約為50 g的健康虹鱒魚70尾，平均分成2組飼養3周。將病毒液(TCID50效價為10-5.47/0.1 mL)通過腹腔注射途徑接種到無任何病癥的健康魚體內，每尾0.3 mL，一共25尾，水溫保持在8 ℃～12 ℃；未接種的健康魚為對照組，連續觀察30 d。

2 結果

2.1 病毒分離 按照1∶10、1∶50、1∶100的比例稀釋的病料組織勻漿上清依次接種到FHM細胞后的第2天、第4天和第7天細胞收縮變圓，出現明顯的空斑，最后大部分細胞崩解、脫落。而未接毒的對照組細胞生長狀態良好(圖1)。

圖1 正常的FHM細胞和接種后出現EPC的FHM細胞(100×)

2.2 病毒滴定測定結果 病毒懸液按照10-1-10-10連續10倍稀釋后接種在單層的FHM細胞中，采用Karber法計算出第二代細胞培養物的TCID50效價為10-5.47/0.1 mL。2.3 IHNV全基因組擴增 通過對RT-PCR反應條件的優化，利用設計的6對特異性引物，擴增出了覆蓋IHNV CJ-13株全基因組6個片段。擴增后的產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測均為單一條帶，且各擴增片段大小與預期值一致(圖2)。

圖2 PCR擴增產物

M：250 bp DNA Ladder；1～6分別為IHNV引物1、2、3、4、5、6

2.4 IHNV全基因序列測定 將RT-PCR擴增的各個基因片段分別連接于pGEM-T Easy 載體，各基因片段分別篩選3個平行陽性重組質粒進行測序。將測得的各段基因序列用DNAStar 軟件進行拼接校正后獲得IHNV全基因序列。該病毒基因組全長為 11 132 nt，基因組序列中4種核苷酸G、A、T、C含量分別為24.28%、28.67%、19.46%、27.59%。對IHNV CJ-13株的基因結構特點進行了分析和預測了蛋白表達量(表2)。與其他彈狀病毒一樣，分離株包含6個基因編碼的蛋白序列，排列方式為3′—N—P—M—G—NV—L—5′。首先是由不能被翻譯的前導區，然后依次是核衣殼蛋白(N登錄號：KR269772)、與聚合酶相關的磷酸蛋白(P登錄號：KR269773)、基質蛋白(M登錄號：KR363256)、糖蛋白(G登錄號：KR537869)、獨特的非病毒結構蛋白(NV登錄號：KR814487)及病毒聚合酶蛋白(L登錄號：KR814488)，最后是5′端的尾隨序列。各基因之間的連接區將結構蛋白基因分離。

2.5 IHNV核蛋白G基因序列分析 與VHSV兩種病毒的N基因極為相似，所以針對N基因設計引物進行RT-PCR難以區分兩種病毒，一般區分 IHNV 都以G基因進行區分，因為IHNV病毒G基因序列變異系數較小[6-7]，將分離株G基因與多株IHNV參考株進行核苷酸同源性比較并做系統發育樹分析，可見分離株G基因與韓國株ChYa07和PcKw11同源性較高，分別為97.8%和97.5%，其推導的氨基酸序列同源性為97.5%和98.2%。與其他參考株核苷酸同源性為94.8%～96.7%，推導出的氨基酸同源性為94.5%～95.8%。從G基因的進化樹上看，分離株G基因與韓國分離的2株相對較近，表明亞洲分離株與美國分離株、歐洲分離株進化關系較遠，明顯不在同一個進化分支上。

3 討論

目前，傳染性造血器官壞死病病毒細胞培養技術依然是水生動物病毒診斷的重要手段，本研究將處理過的疑似病料接種到敏感細胞系FHM中，通過觀察典型的CPE和電鏡檢測病毒形態初步確定為IHNV，采用race-PCR方法，成功擴增出IHNV全基因組序列。

表2 IHNV CJ-13株的基因結構特點及蛋白表達

通過對數據進行分析，其結果顯示，IHNV基因包含6個ORF，分別為核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)、獨特的非病毒結構蛋白(NV)及病毒聚合酶蛋白(L)。G蛋白是傳染性造血器官壞死病病毒編碼抗原決定簇的主要蛋白,能刺激機體產生中和抗體，同時也是個很好的檢測抗原。G蛋白的N端具有一段疏水性的信號肽,在內質網中被切除后成為成熟的G蛋白，所有彈狀病毒G蛋白都屬于單一的I型跨膜糖蛋白，由約500個氨基酸組成。不同屬的彈狀蛋白其G蛋白的氨基酸同源性很低，但在結構組成上較為保守，都含有一個疏水的信號肽、兩個糖基化位點、兩個乙酞化位點和一個疏水的細胞質尾。本研究中分離株的G蛋白基因序列總長1 527 bp，包含G蛋白的全長基因，編碼508個氨基酸，預測表達蛋白量為56 kDa。

我們發現，在細胞接種病料時，剛被處死的活魚和保存于液氮數日的病魚組織均可以使得敏感細胞FHM出現特征性病變。所以溫度是影響IHNV感染發病的重要因素之一[8-9]，水溫在8 ℃～10 ℃時發病率最高，水溫超過15 ℃時可使發病停止。飼養魚苗時，我們給部分正常魚苗更換冷水后在3～8 h內80%魚苗出現了臨床癥狀，12小時內死亡率達到了100%。另外，魚的大小是另一個重要的影響因素，2月齡以下的魚苗死亡率可達100%，7月齡以上的一般僅有10%左右的死亡率[10]。

研究人員等[11]對日本、法國、意大利及美國等地區的323個IHNV 株G基因序進行分析，結果表明，核苷酸的最大變異系數是8.6%，系統進化樹分析結果表明，北美株形成個基因型(U、M 和L)，分布于3個不同的地理區域，M基因型中最大的核苷酸變異為7.6%，是U和L基因型最大變異系數的2倍多，法國和意大利株屬于M基因型，日本株屬于U基因型。在本研究中，核苷酸同源性比對顯示，CJ-13株G基因與韓國株和日本株同源性最高。從結構基因系統發育樹可以看出CJ-13株與韓國和日本分離株的IHNV為同一進化分支。因此預測CJ-13株屬于U基因型，可能由韓國株或者日本株變異而來。

[1] S St-Hi LLarie,C S Ribb Le,C Siephen,etal.Epidemio Logica L investigation of infectious hematopoietic necrosis virus in sa Lt water net-pen reared Atlantic salmon in British Columbia,Canada[J].Aquacu Lture,2002,212:49-67.

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Etiology and whole genome sequence analysis of Infectious hematopoietic necrosis disease virus(IHNV)isolates from epidemic

JIAO Xue1, JI Shang-lei1, ZHANG Pei-jun2, LENG Dong-ze1, MAO An-ting1, LI Yue-hong1

(1.Jilin Agriculture University, College of animal science and technology, Changchun 130118，China 2.Jilin provincial health inspection and Testing Center, Changchun 130118，China)

In order to have a preliminary understanding the pathogenic characteristics of a rainbow trout aquaculture field strain of infectious hematopoietic organ necrosis virus in northeast area,the strains of rainbow trout fry artificial back after experimental infection.The resμlts showed that there were obvious clinical symptoms in the experiment of artificial infection in one week.The mortality of rainbow trout fry polishing filtration sterilization after inocμlation to pantouyu muscle cell line(FHM),the characteristic cytopathic effect(CPE),with six pairs of specific primers of infectious hematopoietic organ necrosis virus(IHNV)4 groups of aquatic animal viruses to the strains of race-PCR,amplifying the fμll-length.The resμlts showed that the total length of the viral genome was 11132 NT,and the contents of 4 nucleotides G,A,C and T were 24.28%,28.67%,19.46%,27.59%,,,respectively.Comparison of the corresponding genes of IHNV strains published in GenBank with mμltiple strains.The resμlts showed that the G gene of the isolates was higher than that of ChYa07 and PcKw11 in South Korea,97.8% and 97.5%,respectively.The resμlts showed that the CJ-13 strain was relatively close to the South Korean and the Japanese strains.

Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; Epidemic etiology; complete sequence Corresponding author：LI Yue-hong

2016-06-15

國家自然科學基金(30972191)；吉林省留學人員創新創業項目(201523)；長春市農業先進實用技術的示范推廣項目(20130215)；農業部948項目(2014Z34)

焦雪(1992- )，女，研究生，主要從事動物疾病及免疫研究，E-mail:455261939@qq.com

李月紅，E-mail:liyhong@sina.com

S855.3

A

0529-6005(2017)03-0039-04