小反芻獸疫實驗室診斷

王 琦 ， 吳 燕 ， 程振濤 ， 李 濤

(1.貴州大學動物科學學院 ， 貴州貴陽550025 ； 2.貴州省動物疫病預防控制中心 ， 貴州貴陽550008)

小反芻獸疫實驗室診斷

王 琦1， 吳 燕1， 程振濤1， 李 濤2

(1.貴州大學動物科學學院 ， 貴州貴陽550025 ； 2.貴州省動物疫病預防控制中心 ， 貴州貴陽550008)

為了對小反芻獸疫疑似病例進行實驗室確診，采集疑似小反芻獸疫病羊材料，用實時熒光定量RT-PCR檢測方法以及一步法RT-PCR檢測方法進行檢測，并針對小反芻獸疫N基因序列設計引物擴增N基因并進行克隆測序及序列分析。試驗結果可見，疑似小反芻獸疫病羊臨床剖檢表現為胃腸道及肺部出現壞死，腸道出現線狀出血。實時熒光定量RT-PCR和一步法RT-PCR方法檢測結果顯示均為小反芻獸疫病毒(PPRV)核酸陽性。N基因測序結果China-GZ株與小反芻獸疫4個支系毒株序列比對顯示，核苷酸同源性為89.0%～97.3%。本試驗通過臨床癥狀表現和實驗室分子生物學診斷確診該病例為小反芻獸疫病毒感染所致。

小反芻獸疫 ； 剖檢病變 ； RT-PCR ；N基因

小反芻獸疫(PPR)是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性、烈性傳染病。該病自1942年首次在西非象牙海岸的科特迪瓦發現后，一直呈擴散趨勢，目前全球有40多個國家已報告發生該疫情[1]。該病主要以高稽留熱、眼鼻分泌物增多、壞死性口炎、肺炎、腹瀉為主要特征[2]。主要感染山羊與綿羊，其中山羊比綿羊更易感。2007年，我國西藏首次暴發小反芻獸疫疫情[3]。自2013年11月份起，我國多省陸續暴發小反芻獸疫疫情，貴州省小反芻獸疫疫情也十分嚴峻。目前針對本病現在尚無有效的治療方法。對本病綜合防控依賴于臨床病例的快速診斷、果斷處置，同時亦應及時明確各地小反芻獸疫流行毒株分子特征，為疫苗防控奠定基礎。本試驗通過對臨床疑似小反芻獸疫山羊病例進行剖檢病變觀察及樣本采集，并利用實時熒光定量RT-PCR檢測方法和本實驗室建立一步法RT-PCR檢測方法對該病例進行確診。并對小反芻獸疫病毒本地流行株保守基因N基因進行克隆、測序及序列分析，為貴州省小反芻獸疫病例快速處置及綜合防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料 疑似病羊材料采集自貴州省六盤水市某養羊場。

1.2 載體與試劑 pMD-19T載體，購自寶生物工程(大連)有限公司；小反芻獸疫實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；RNA提取試劑盒、E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit 膠回收、E.Z.N.A.TMPlasmid Kit 質粒提取試劑盒，購自Omega公司；DNA限制性內切酶SalⅠ和KpnⅠ，均購自Thermo公司；DNA Marker DL-2 000，購自寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑均為國產分析純。1.3 方法

1.3.1 臨床病例觀察與樣本采集 按照重大疫病樣本采集與病例處置要求，對臨床病例進行流行病學調查與剖檢病變觀察，并采集肺、糞便等樣本，以備實驗室檢驗。

1.3.2 實時熒光定量RT-PCR方法檢測 提取疑似病例樣本總RNA為模板，用北京世紀元亨動物防疫技術有限公司小反芻獸疫實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒進行檢測(批號：PPR20150404P)。試驗結果陽性對照Ct值≤30并出現特定的擴增曲線，陰性對照無Ct值并且無特定擴增曲線，試驗結果成立；被檢樣品Ct值≤30并出現特定的擴增曲線為小反芻獸疫病毒陽性；被檢樣品30

1.3.4 N基因的克隆與序列分析

1.3.4.1 引物的設計 根據GenBank所登錄的小反芻獸疫病毒N基因序列，設計合成一對引物，PPRV-N-F：5′-ATGGCGACTCTTCTTAAAAG-3′，PPRV-N-R：5′-CTAGCCGAGGAGATCCTTGT-3′，預期擴增片段大小為1 578 bp，送至上海生工生物工程技術服務有限公司合成，稀釋引物至20 pmol/μL，-20 ℃保存備用。

1.3.4.2 目的片段的擴增 提取臨床疑似病例組織樣本總RNA為模板，用引物PPRV-N-F/ PPRV-N-R進行目的基因擴增。采用50 μL反應體系： RNA模板1 μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 2 μL，2×1 step Buffer 25 μL，上下游引物各1 μL，RNase Free dH2O 20 μL。反應條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，共35個循環。RT-PCR產物經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀中觀察結果。

1.3.4.3 目的片段的克隆 用膠回收試劑盒純化RT-PCR產物，按照pMD19-T載體試劑盒說明書將回收目的基因片段與pMD19-T載體連接，轉化感受態細胞DH5α，應用PCR及SalⅠ/KpnⅠ雙酶切(酶切體系:質粒DNA 9 μL，SalⅠ 4μL，KpnⅠ 2 μL，Buffer Tango 7 μL，滅菌雙蒸水補足至30 μL)技術篩選陽性重組質粒。

1.3.4.4 測序、序列分析 將陽性重組質粒送至上海英濰捷基生物技術有限公司測序。將測序結果與GenBank上PPRV 4個支系毒株N基因序列進行比對分析。

表1 參考毒株信息

2 結果

2.1 疑似病例臨床表現觀察 送檢病羊出現口鼻分泌液增加、牙齦充血、口腔糜爛、咳嗽、腹瀉等癥狀，臨床診斷疑似小反芻獸疫。剖檢后發現病羊胸腔有炎性滲出液蓄積及肺部出現不同程度的壞死，其他主要表現為肝臟及脾臟、淋巴結腫大，腸道出現線狀出血。

2.2 疑似病例FQ RT-PCR檢測結果 疑似病例組織樣本總RNA進行實時熒光定量RT-PCR，結果見圖2。根據判定標準對檢測結果進行判定，由圖1可見，陽性對照Ct值為17.40<30.00并出現特定的擴增曲線，陰性對照無Ct值并且無特定擴增曲線，試驗結果成立。臨床樣本1和2Ct值分別為18.09和23.94，均小于30并出現特定的擴增曲線，故判定為小反芻獸疫病毒核酸陽性。

圖1 小反芻獸疫病毒RNA的擴增曲線

+：陽性對照； 1-2：臨床樣本； -：陰性對照

2.3 疑似病例普通RT-PCR擴增結果 為進一步確診，對疑似病例材料總RNA進行一步法RT-PCR擴增，RT-PCR產物凝膠電泳結果見圖2。由圖2可見，臨床疑似樣本擴增出大小約447 bp的核酸條帶，與陽性對照大小相同，判斷為疑似病例小反芻獸疫病毒核酸陽性。

圖2 臨床樣本檢測結果

M：DL2000 DNA Marker；+：陽性對照；1-2：臨床樣本；-：陰性對照

2.4N基因克隆 應用所設計N基因引物對其中1份疑似病例樣本總RNA進行目的基因擴增，樣本中擴增出大小約1 578 bp目的條帶，與預期擴增大小相符。將膠回收純化后的目的片段連接至pMD19-T載體并轉化感受態細胞DH5α，提取重組質粒進行PCR和SalⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定，結果見圖3和圖4。由圖3可見，重組質粒中PCR擴增出約1 578 bp的目的條帶；由圖5可見重組質粒經SalⅠ/KpnⅠ雙酶切可獲得與目的條帶大小相同的目的片段，證明目的基因片段成功克隆到pMD19-T載體。

圖3 重組質粒PCR鑒定

M： DL-2 000 DNA Marker； 1～3： 重組質粒PCR產物

圖4 重組質粒酶切鑒定

M： DL-2 000 DNA Marker； 1～3： 陽性重組質粒雙酶切產物； 4： 重組質粒對照

2.5N基因測序結果 將鑒定為陽性的重組質粒送至上海英濰捷基生物技術有限公司測序，測序結果得到大小為1 578 bp的目的基因序列，暫命名為China-GZ株。

2.6N基因與PPR不同支系核苷酸比對分析 將China-GZ株序列與小反芻獸疫4個支系毒株序列進行對比顯示(圖5)：China-GZ株與4個支系毒株核苷酸同源性分別為93.2%，92.7%，89.0%和97.3%，初步斷定本次病例流行毒株小反芻獸疫病毒Ⅳ系。

圖5 核苷酸同源性比對分析

3 討論

2013年以來，我國多個省份均出現小反芻獸疫疫情，小反芻獸疫的防控迫在眉睫。對臨床病例的快速診斷是防控小反芻獸疫的關鍵技術之一，針對小反芻獸疫病原的診斷方法包括免疫學檢測方法和分子生物學檢測方法。免疫學檢測方法包括瓊脂凝膠免疫擴散試驗(AGID)、瓊脂凝膠沉淀試驗(AGPT)、對流免疫電泳試驗(CIE)及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等[4]，但相對于這些檢測方法，分子診斷技術中的PCR方法更加靈敏[5]。目前針對PPRV診斷技術建立可見基于PPRVN、F、M基因設計引物[6-8]。方法可分為普通RT-PCR方法和實時熒光定量PCR方法，其中實時熒光定量PCR方法更敏感，而普通RT-PCR檢測結果更直觀。本試驗根據病羊臨床表現為口鼻分泌液增加、口腔糜爛、咳嗽、腹瀉等癥狀，剖檢病羊胸腔存在炎性滲出液蓄積，胃腸道及肺部出現不同程度的壞死，肝臟及脾臟、淋巴結腫大，腸道出現線狀出血，與王光祥等[9]觀察到的小反芻獸疫病變相似，初步懷疑為小反芻獸病毒感染。為做出確切性診斷，分別采用實時熒光定量RT-PCR技術和普通一步法RT-PCR技術對上述疑似病例進行分子生物學診斷，兩種方法均顯示臨床疑似小反芻獸疫病例組織樣本中存在PPRV核酸。可初步判定病例存在小反芻獸疫病毒感染。

小反芻獸疫防控采取凈化與疫苗免疫相結合的方式進行[10]，隨著山羊交易與引種的頻繁發生，疫苗免疫仍是健康羊群的有效保護手段。疫苗免疫對疫病防控能否成功建立在病原種類、分子特征是否一致的基礎之上。小反芻獸疫基因組包括N基因、P基因、M基因、F基因、H基因和L基因，其中編碼核蛋白的N基因在麻疹病毒屬的基因組中是非常保守的，目前小反芻獸疫的ELISA、PCR等檢測方法多數都是以N基因為基礎建立的[11]。N基因所編碼的N蛋白是PPRV中最豐富且免疫原性最強的蛋白[12]，動物機體感染以后能夠引起其機體產生高滴度抗體，此類抗體雖然不能中和病毒，但是具有重要的診斷意義[13]。為進一步確診本次臨床病例和了解PPRV本地流行株分子特征，本試驗選取PPRVN基因進行克隆及測序，并將測序結果與小反芻獸疫四個支系毒株進行比對分析。結果可見，PPRV本地流行株與4個支系毒株核苷酸同源性高達89.0%～97.3%，證明擴增出的基因為PPRVN基因。同時分析結果顯示，China-GZ株與疫苗株Nigeria 75-1株核苷酸同源性為93.2%，而與第四支系毒株India株同源性高達97.3%，提示本地流行株可能與India株同屬小反芻獸疫第四支系，與疫苗株屬于不同支系。研究結果為貴州省小反芻獸疫綜合防控奠定基礎。

[1] 劉永宏,曹勝波,趙麗,等.中國小反芻獸疫疫情分析[J].西北農業學報,2014,23(9): 19-26.

[2] Kerur N,Jhala M K,Joshi.Genetic characterization of Indian peste des petits ruminants virus (PPRV) by sequencing and phylogenetic analysis of fusion protein and nucleoprotein gene segments[J].Res Vet Sci，2007,85(1):176-183.

[3] 王樂元,次真,吳國珍,等.中國西藏小反芻獸疫的發生狀況與防控[J].畜牧獸醫學報,2011,42(5):717-720.

[4] 姚偉.國外小反芻獸疫實驗室診斷技術研究進展[J].中國獸醫雜志,2015,51(6):79-81.

[5] 袁向芬,吳紹強,林祥梅.小反芻獸疫診斷及其免疫防制的研究進展[J].中國畜牧獸醫,2012,39(12):195-198.

[6] Carrie A B,Ashley C B,Donald P K,etal.A real time RT-PCR assay for the specific detection of Peste des petits ruminants virus[J].J Virol Methods,2011,171(2):401-404.

[7] Albayrak H,Alkan F.PPR virus infection on sheep in blacksea region of Turkey: Epidemiology and diagnosis by RT-PCR and virus isolation[J].Vet Res Commun,2009,33(3):241-249.

[8] Balamurugan V,Sen A,Venkatesan G,etal.A rapid and sensitive one step-SYBR green based semi quantitative real time RT-PCR for the detection of peste des petits ruminants virus in the clinical samples[J].Virol Sin,2012,27(1):1-9．

[9] 王光祥,賈寧,方梅,等.綿羊小反芻獸疫臨床病例的病例學觀察[J].畜牧獸醫學報,2015,46(6):1011-1017.

[10] 陳未,陳飛,周偉偉.小反芻獸疫研究進展[J].中國獸醫雜志,2014,50(7):59-60.

[11] 艾軍,楊建明,葉玲玲,等.小反芻獸疫病毒N基因的克隆及原核表達[J].動物醫學進展,2008,29(5):1-3.

[12] Yadav V,Balamurugan V,Bhanuprakash V，etal.Expression of Peste des petits ruminants virus nucleocapsid protein in prokaryotic system and its potential use as a diagnostic antigen or immunogen[J].J Virol Methods,2009,162(1):56-63．

[13] Balamurugan V,Sen A,Saravanan P,etal.One-step multiplex RT-PCR assay for the detection of peste des petits ruminants virus in clinical samples[J].Vet Res Commun,2006,30(6):655-666．

2015-10-15

貴州省科技合作項目(黔科合LH字[2015]7674號)；省州科技合作專項項目 (黔西南科合[2012]5號)；貴州省科技創新人才團隊項目(黔科合人才團隊[2015]4016號

王琦(1991-)，女，碩士，主要從事預防獸醫學研究，E-mail:862708743@qq.com

程振濤， E-mail: chengzhentao@sohu.com；李濤， E-mail: 727670509@qq.com

2.65

A

0529-6005(2017)03-0035-04