鑒別犬瘟熱病毒強弱毒株SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

由叢華 ， 張傳美 ， 張洪亮 ， 秦志華 ， 楊海燕 ， 單 虎

(1.青島農業大學山東省預防獸醫學重點實驗室 ， 山東青島266109; 2.山東省蓬萊市畜牧局 ， 山東蓬萊 264003)

鑒別犬瘟熱病毒強弱毒株SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

由叢華1,2， 張傳美1， 張洪亮1， 秦志華1， 楊海燕1， 單 虎1

(1.青島農業大學山東省預防獸醫學重點實驗室 ， 山東青島266109; 2.山東省蓬萊市畜牧局 ， 山東蓬萊 264003)

為建立犬瘟熱強弱毒株SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法，根據GenBank公布的犬瘟熱毒株的全基因序列并參考相關文獻，選擇M基因保守區域合成了1對通用引物M1/M4及鑒別犬瘟熱強弱毒株的特異引物M2和M3。試驗證明，該方法重復性良好；檢測強弱毒株的最低檢出限度在10拷貝；對新城疫病毒、水貂腸炎病毒、阿留申病毒、犬腺病毒、犬細小病毒5種病毒的特異性檢測均為陰性；對175份犬瘟熱疑似病料進行熒光定量RT-PCR，檢出127份陽性樣品，其中強毒株98份，弱毒疫苗株29份，常規RT-PCR檢出112份陽性樣品。結果表明，該方法的敏感性高于常規RT-PCR檢測，并能有效的鑒別強弱毒株。

犬瘟熱病毒 ； SYBR Green I 熒光定量RT-PCR ； 強弱毒株 ； 鑒別

犬瘟熱(Canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種犬類高度接觸性傳染病，可感染犬科、鼬科等多種動物，成為當前危害養犬業、毛皮動物養殖業和野生動物保護業最大疫病之一。目前傳統的診斷方法中[1-2]，膠體金試劑盒檢測方法雖然快速，但是準確率低[3]并無法用來區分強弱毒株；常規RT-PCR檢測方法存在假陽性、耗時長等缺點[4]。熒光定量RT-PCR技術實現了對模板準確定量，具有特異性強、重復性好和結果直觀可定量并能區分強弱毒株等優點，已得到廣泛的應用[5]。本研究使用SYBR Green I 熒光定量RT-PCR技術通過特異性引物對犬瘟熱強弱毒株進行區分，建立了犬瘟熱強弱毒株的SYBR Green I 熒光定量PCR檢測方法，該方法為快速準確的區分犬瘟熱強弱毒株提供了有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 毒株、試劑及儀器 犬瘟熱野毒株(命名為CDV-Y，H全基因測序為野毒株)1株；犬瘟熱弱毒疫苗株(CDV-3株)；新城疫疫苗株(NDV-B1株)；水貂腸炎病毒(MEV)、阿留申病毒(ADV)、犬腺病毒(CAV)、犬細小病毒(CPV)毒株及病料均由山東省預防獸醫學重點實驗室保存。RNA iso plus，質粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒，pMD19-T載體，E.coli、DH5α等，購自寶生物工程(大連)有限公司；熒光定量PCR 儀(Rotor-gene3000)為美國Gene公司。

1.2 引物的設計 根據GenBank公布的犬瘟熱毒株的全基因序列并參考相關文獻[6]，選擇M基因保守區4264～4861 bp間，合成一對通用引物M1和M4(擴增片段為600 bp)。根據強弱毒株間有差別區域，合成位于兩對通用引物中的強弱毒株的特異引物M2和M3，M2/M4可特異性擴增強毒株(擴增片段為247 bp)，M3/M4可特異性擴增弱毒株(擴增片段為177 bp)。

M1:5′-AAATCCTGTGTTACCCGCTC-3′；M2:5′-TGGTGGCTCTGCAATATGAA-3′；M3:5′-AATGAATGGATGCCTGGGGTTT-3′；M4:5′-CAAAACTTAGGGTCCAGGAC-3′；1.3 標準品的制備 對強毒株CDV-Y和弱毒株CDV-3提取RNA，進行反轉錄，以反轉錄cDNA為模板，用引物M1/M4、M2/M4、M3/M4進行常規RT-PCR，膠回收后連接pMD19-T載體中，轉入DH5α獲得野毒株和疫苗株的重組質粒并測其質粒濃度，換算為拷貝數作為標準品。

1.4 標準曲線及熔解曲線的繪制 分別以M2/M4為強毒株上下游引物，以M3/M4為弱毒疫苗株上下游引物，將犬瘟熱強弱毒株標準品按照107～101倍比稀釋作為模板，25 μL的反應體系為：SYBR Primix ExTaq12 μL、0.1 nmol/L強弱毒株上、下游引物各1 μL；質粒標準品稀釋的模板1 μL、無菌水10 μL。最佳反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環。溶解曲線分析溫度為78 ℃～95 ℃。經軟件分析后得到犬瘟熱強弱毒株標準曲線和熔解曲線。

1.5 敏感性、特異性及重復性試驗 用強弱毒株拷貝數依次為1.0×107～1.0×101copies/μL進行SYBR Green I熒光定量RT-PCR，進行敏感性試驗；分別對強弱毒株質粒標準品與NDV、MEV、ADV、CAV、CPV的cDNA，分別用引物M2/M4和M3/M4進行單一熒光定量RT-PCR 檢測，確定該方法的特異性試驗；分別取強弱毒株的1.0×102、1.0×104、1.0×106三個稀釋度標準品，進行組內及組間的重復性試驗，并且計算組內及組間的變異系數。

1.6 臨床樣品檢測 對采集的175份由膠體金試劑檢測陽性疑似犬瘟熱病料，研磨為組織懸液并提RNA后用Oligo DT反轉錄為cDNA，分別用引物M2/M4和M3/M4對病料進行SYBR Green I 熒光定量RT-PCR檢測，同時用通用引物M1/M4進行常規RT-PCR檢測。

2 結果

2.1 PCR結果及標準品的制備 犬瘟熱強毒株(CDV-Y)和弱毒疫苗(CDV-3)的PCR產物分別出現大小為600 bp、247 bp和177 bp的條帶，與預期的目的條帶的大小相一致(圖1)。分別對目的條帶膠回收純化，連接轉化后提取質粒，質粒經過PCR鑒定為目的條帶。

圖1 犬瘟熱強弱毒株PCR產物

M： DL-1 000 DNA Marker； 1：強毒株CDV-Y； 2：弱毒株CDV-3疫苗株； 3：陰性對照

圖A：引物M1/M2分別擴增強弱毒株條帶； 圖B：引物M2/M4和M3/M4分別擴增強弱毒株條帶

2.2 熒光定量PCR方法的建立 建立強、弱毒株標準曲線呈現良好的線性關系，相關系數分別為R2=0.998和R2=0.996。動力學曲線顯示，強弱毒株的Tm值分別在78 ℃±0.5 ℃和79 ℃±0.5 ℃，強弱毒株均無引物二聚體及非特異擴增峰。

2.3 敏感性試驗 強弱毒株的熒光定量RT-PCR的最小檢測量均為101，標準曲線在 l07-101呈現較好的線性關系(見中插彩版圖2)。

2.4 特異性試驗 建立的單一熒光定量PCR均能檢測出強弱毒株，而對NDV、MEV、ADV、CAV、CPV無閾值信號產生(見中插彩版圖3)。結果表明，該方法在強弱毒株檢測中有很好的特異性。

2.5 重復性試驗 選取1.0×102、1.0×104、1.0×106三個稀釋度標準品作為模板對兩套引物進行批間和批內測試，結果表明，兩套引物的變異系數均小于2%，說明其重復性良好(表1)。

表1 強弱毒株批內及批間重復性試驗

2.6 臨床樣品檢測 應用建立的強弱毒株SYBR Green I 熒光定量RT-PCR和常規RT-PCR，對175份犬瘟熱疑似病料進行檢測。熒光定量RT-PCR共檢出陽性樣品127份，其中強毒株98份，弱毒疫苗株29份；常規PCR僅檢出陽性樣品112份。臨床檢測證明建立的熒光定量RT-PCR具有更高的敏感性。

3 討論

目前，疫苗是預防和治療犬瘟熱最有效的方法，被廣泛應用于毛皮動物養殖及寵物飼養和野生動物保護等領域，但由于野毒株變異的長期積累，CDV疫苗株可能已經不能對所有的CDV流行株產生有效的保護，這可能是導致免疫失敗的主要原因之一，另外近幾年來經常有免疫的犬或水貂暴發犬瘟熱的現象發生。

為了鑒別犬瘟熱強毒株還是疫苗株對動物的感染，YiLi等[7]人通過對CDV H基因氨基酸的比對發現，在331位和502位氨基酸殘基上存在差異從而設計野毒株與疫苗株PCR鑒別引物，楊天闊等[10]人通過比對野毒株與疫苗株H基因設計特異性引物，建立用于鑒別檢測CDV野毒株與疫苗株的RT-LAMP檢測方法。這些方法雖然能夠區分強弱毒株，但在靈敏度方面與熒光定量PCR檢測方法相比存在一定的差距[9]。雖然現在已有關于建立熒光定量PCR檢測犬瘟熱病毒的方法，但并未有熒光定量PCR檢測方法對強弱毒株進行鑒別區分。本研究通過CDV強弱毒株特異性引物，優化反應條件，建立了區分強弱毒株的SYBR Green I 熒光定量檢測方法。通過驗證該方法敏感性、特異性和重復性良好，閉管檢測無需PCR后處理，避免了樣品間的交叉污染，臨床檢測效果良好，說明本方法可廣泛用于毛皮動物養殖業及寵物飼養和野生動物保護等領域強弱毒株臨床檢測中，及時區分強弱毒株感染，指導疫苗使用和藥物使用情況。

[1] 劉雯. 犬瘟熱研究進展[J]．動物醫學進展，2010，31(8)：83-87．

[2] 張鴻，胡傳莉，翟曉虎．犬瘟熱病毒單抗夾心ELISA檢測方法的建立[J]．揚州大學學報，2011，12：4-32．

[3] Rzezutka A, Mizak B. Application of N-PCR for diagnosis of distemper in dogs and fur animals [J]. Vet Microbiol，2002,88(1):95-103.

[4] 袁書智. 犬瘟熱熒光抗體技術的應用研究[J]．中國獸醫學報，1994，14(2)：146-150.

[5] Perpinán D，Ramis A. Tomás A，etal. Outbreak of canine distemper in domestic ferrets (Mustela putorius furo) [J]. Vet Rec, 2008,163:246-250.

[6] 司微.鑒別犬瘟熱病毒強毒株和弱毒株的復合RT-nPCR方法的建立及初步應用[D].北京:中國農業科學院,2007.

[7] Yi Li，Cheng Shi-peng，Xu Hong-li，etal. Development of a combined canine distemper virus specific RT-PCR protocol for the differentiation of infected and vaccinated animals (DIVA) and genetic characterization of the hemagglutinin gene of seven Chinese strains demonstrated in dogs [J]. J Virol Methods,2012,179(1):281-287.

[8] 楊天闊，劉大飛，曲連東，等．犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株鑒別檢測RT- LAMP方法的建立[J]．中國預防獸醫學報，2012，34(6)：460-467．

[9] 蘇建青. 犬瘟熱免疫層析試紙及熒光定量PCR診斷方法的建立與評價[D].長春:吉林大學,2008.

Development of a SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR assay for detection and identification wild-type and vaccine strain of canine distemper virus

YOU Cong-hua1，2, ZHANG Chuan-mei1, ZHANG Hong-liang1, QIN Zhi-hua1，YANG Hai-yan1, SHAN Hu1

(1.Shandong Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China； 2.The Livesfock Bureau of Penglai at Shandong Province, Penglai 264003, China)

SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR was developed for the detection and identification of wild-type and vaccine strains of canine distemper virus(CDV).According to the differences of whole gene sequence of M gene in the strains of CDV in Genebank, two pairs of primers, universal primer M1 and M4 and specific primers M2 and M3 were designed to differentiate wild-type and vaccine strain of CDV. The developed RT-PCR could detect minimum 10 copies for wild-type and vaccine strains and specifically differentiate NDV,MEV,ADV,CAV,and CPV. SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR and normal PCR detected 127 positive samples and 112 positive samples,respectively. Twenty-nine positive samples were vaccine strain in 127 positive samples detected by SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR. This results show that the sensitivity of this assay is higher than normal RT-PCR, which can also differentiate wild-type and vaccine strains of CDV.

Canine distemper virus; SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR; wild-type and vaccine strain; identification.

s：ZHANG Chuan-mei； SHAN Hu

2014-12-31.

公益性行業(農業)科研專項(201303042)；科技基礎性工作專項(科技部)(2012FY111000)

由叢華(1989-)，男，碩士，研究方向為動物傳染病防治，E-mail: youconghua@163.com

張傳美，E-mail:zhangchuanmei100@163.com；單虎，E-mail:shanhu67@163.com

S852.65+5

A

0529-6005(2017)03-0023-03