微小牛蜱唾液菌群的PCR-DGGE分析

向亮亮 ， 唐 歡 ， 程天印

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 湖南長沙410128)

微小牛蜱唾液菌群的PCR-DGGE分析

向亮亮 ， 唐 歡 ， 程天印

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 湖南長沙410128)

為了解微小牛蜱唾液內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)信息，采用PCR-DGGE技術(shù)對微小牛蜱半飽血、飽血雌成蟲唾液內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)進行了分析和比較，結(jié)果表明：微小牛蜱半飽血、飽血雌成蟲唾液內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)有較大差異，飽血中細菌比半飽血多兩種，分別為莫拉菌和不動桿菌；唾液內(nèi)菌群與全蜱菌群差異極大。在檢出的細菌中多數(shù)具有一定的致病性，故微小牛蜱叮咬可能會引起人或動物發(fā)生多種細菌性疾病。

DGGE ； 微小牛蜱 ； 唾液 ； 細菌

微小牛蜱是我國的優(yōu)勢蜱種之一，廣泛分布于澳洲、亞洲、非洲和美洲，我國的華北、華中、華東、華南和西南等地區(qū)也普遍存在，侵襲人和黃牛、水牛、牦牛、驢、馬、山羊、綿羊、犬、貓等多種動物，是巴貝斯蟲病、雙芽巴貝西蟲病、北亞蜱媒斑疹傷寒、萊姆病、Q熱等疾病的傳播媒介，其中唾液傳播是其最主要的方式[1]，但迄今為止僅Budachetri對海灣花蜱的唾液菌群結(jié)構(gòu)進行了分析[2]，至于其唾液中含有哪些細菌國內(nèi)外尚未見報道。DGGE-PCR技術(shù)是一種用于檢測DNA突變的電泳技術(shù)，能夠?qū)㈤L度相同但序列不同的DNA片段分離開來。本研究采用PCR-DGGE技術(shù)分析微小牛蜱唾液的菌群結(jié)構(gòu)，旨在了解微小牛蜱唾液在疾病傳播方面的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微小牛蜱 采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)郊區(qū)黃牛，光學(xué)顯微鏡下經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為微小牛蜱。

1.1.2 主要試劑及儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；2×EasyTaqPCR Super Mix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pEASY-T1 Cloning Kit試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DGGE變性梯度凝膠電泳儀(DGGEK-2001)，購自CBS公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 取半飽血、飽血雌成微小牛蜱(雌、成蟲)若干只，按照廖芷卉[3]等人介紹的方法分別采集唾液。蟲體于液氮中研磨成粉，加適量滅菌生理鹽水，制成懸液，于400 r/min離心5 min，上清液備用。

取全蜱懸液和唾液各30 μL，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取細菌DNA。

1.2.2 細菌16S rDNA V3 區(qū)擴增 以全蜱或唾液細菌總DNA為模板、341F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和907R(5′-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3′)為引物分別擴增各樣品。以上述擴增產(chǎn)物為模版341F-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCCGGGGGGCCTACGGGAG-GCAGCAG-3′)和518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)為引物進行第二輪擴增，制備全蜱、唾液細菌16S rDNA V3區(qū)。反應(yīng)體系(50.00 μL)為：模板 0.50 μL，上、下游引物(10.00 μmol/L)各1.00 μL，EasyTaq mixture 25.00 μL，ddH2O 22.50 μL，PCR反應(yīng)條件參照Schabereiter-Gurtner的方法[4]進行。產(chǎn)物5.00 μL于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.3 細菌16S rDNA V3 片段DGGE電泳 按30%～60%變性劑濃度梯度制備6%聚丙烯酰胺凝膠膠(40%去離子甲酰胺和7.00 mL/L尿素為100%變性劑)；移半飽血、飽血全蜱及其唾液細菌16S rDNA V3區(qū)擴增產(chǎn)物各10.00 μL至點樣孔；電泳條件為：60 ℃，170 V，電泳16.5 h。EB染色20 min，觀察結(jié)果。以Quantity One4.6.2繪制DGGE電泳譜示意圖、展示其差異性。

1.2.4 片段回收、克隆、測序及其分析 切取DGGE膠中的各明亮、清晰的條帶；洗滌后以DNA片段快速純化回收試劑盒純化。產(chǎn)物與pEasy-T1載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliTrans1-T1感受態(tài)細胞，選擇陽性克隆，送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測序。

上傳所得序列，BLAST比對，收集最為相近的序列。

2 結(jié)果與討論

2.1 16S rDNA V3區(qū)擴增片段 樣品經(jīng)兩輪PCR擴增，所得16S rDNA V3 區(qū)片段大小約200 bp，與預(yù)計相符(圖1)。

圖1 四樣品細菌16S rDNA V3區(qū)擴增片段

M：Marker； 1：半飽血全蜱； 2：半飽血蜱唾液； 3：飽血全蜱； 4：飽血蜱唾液； N：空白對照

2.2 細菌16S rDNA V3區(qū)DGGE電泳結(jié)果分析 DGGE電泳結(jié)果顯示：半飽血、飽血微小牛蜱(雌、成蟲)唾液菌群結(jié)構(gòu)差異較大，其中飽血蜱唾液含優(yōu)勢菌14種，半飽血微小牛蜱(雌、成蟲)唾液僅有12種。半飽血、飽血微小牛蜱(雌、成蟲)全蜱優(yōu)勢菌相似，但不同菌種的豐度有些許的差異；無論在半飽血蜱、還是飽血蜱，其唾液的菌群結(jié)構(gòu)均與全蜱有極大的不同，見圖2。

圖2 四樣品細菌16S rDNA V3區(qū)擴增片段DGGE電泳圖

Wb：半飽血全蜱； Tb：半飽血蜱唾液； WB：飽血全蜱； TB：飽血蜱唾液； N：陰性對照

2.3 優(yōu)勢條帶序列比對結(jié)果與分析 本試驗從DGGE膠中采集條帶14個，各片段DNA序列比對結(jié)果如表1。

表1 DGGE回收條帶序列比對結(jié)果

在檢出的14種菌中，除皮氏立克次體、不可培養(yǎng)的γ變形菌和擬桿菌外，其他11種菌類均已有致人發(fā)病的報道，暗示微小牛蜱有較大的潛在傳病風(fēng)險。在檢出的細菌中，皮氏立克次體已在微小牛蜱[5]和安氏革蜱檢出[6]，故筆者支持Niebylski[7]的看法。Niebylski認為皮氏立克次體為蜱蟲胞內(nèi)共生菌，對蜱蟲的生長和發(fā)育有著重要作用。

就全蜱而言，半飽血雌成蜱的優(yōu)勢菌種類較飽血的更多，與Heise[8]等的研究結(jié)果一致。陳小玲[9]等認為，蜱類中腸免疫可分泌多種抗菌物質(zhì)，能抑殺體內(nèi)部分細菌，以致吸血過程中蜱內(nèi)細菌常有先增后減的現(xiàn)象。與之相反，半飽血雌成蜱唾液內(nèi)優(yōu)勢菌種類較飽血雌成蜱唾液內(nèi)的少，這可能與不同細菌的繁殖速度有關(guān)。Reif[10]、Kocan[11]和侯雨豐[12]等人的研究表明，一些細菌如土拉弗朗西斯菌、邊緣無形體和立克次體均能在蜱蟲唾液腺生長發(fā)育，但不同細菌繁殖的速度不同，如大腸桿菌繁殖一代僅需15～30min[13]，而立克次體卻長達9～12 h[14]。

無論在飽血中還是在半飽血中，唾液內(nèi)細菌種類均較全蜱為多，這可能與菌類在蜱體內(nèi)的發(fā)育部位和本試驗所采用的檢測方法有關(guān)。Silva和Fikrig[15]證實，一些細菌在蜱蟲中腸定居，在唾液腺繁殖、發(fā)育，而后排至唾液。這些細菌在唾液中的相對含量較高，在全蜱中相對含量不一定很高。PCR-DGGE技術(shù)無法檢出低于1%的類群[16]，故以唾液為樣品檢出的細菌，在全蜱樣中不一定能檢出。

由于DGGE技術(shù)的局限性，本研究獲得的僅是唾液內(nèi)部分菌種信息，至于唾液和蜱蟲所帶菌的詳情，則需更加精密的手段，如高通量技術(shù)。

[1] 曹務(wù)春,張習(xí)坦,許榮滿.蜱類及蜱媒疾病的公共衛(wèi)生學(xué)意義[J].中國公共衛(wèi)生,1999，39(3):221-222.

[2] Budachetri K,Browning R E,Adamson S W,etal.An insight into the microbiome of the Amblyomma maculatum (Acari: Ixodidae)[J].Journal of Medical Entomology,2014,51(1):119-129.

[3] 廖芷卉，唐昊，程天印.蜱類唾液的采集方法[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2015(7):30.

[4] Schabereiter-Gurtner C,Lubitz W,R?lleke S.Application of broad-range 16S rRNA PCR amplification and DGGE fingerprinting for detection of tick-infecting bacteria[J].Journal of Microbiological Methods,2003,52(2):251-260.

[5] Xu X L,Cheng T Y,Yang H,etal.Identification of intestinal bacterial flora in Rhipicephalus microplus ticks by conventional methods and PCR-DGGE analysis[J].Experimental & Applied Acarology,2015,66(2):1-12.

[6] Mattila J T,Munderloh U G,Kurtti T J.Rickettsia peacockii,an endosymbiont of Dermacentor andersoni,does not elicit or inhibit humoral immune responses from immunocompetent D.andersoni or Ixodes scapularis cell lines[J].Developmental & Comparative Immunology,2007,31(11): 1095-1106.

[7] Niebylski M L,Schrumpf M E,Burgdorfer W,etal.Rickettsia peacockii sp.nov.,a new species infecting wood ticks,Dermacentor andersoni,in western Montana[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1997,47(2):446-452.

[8] Heise S R,Elshahed M S,Little S E.Bacterial diversity in Amblyomma americanum (Acari: Ixodidae) with a focus on members of the genus Rickettsia[J].Journal of medical entomology,2010,47(2): 258-268.

[9] 陳小玲,黃志清.蜱源抗菌多肽的研究進展[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2009,39(4):372-375.

[10] Reif K E,Palmer G H,Ueti M W,etal.Dermacentor andersoni transmission of Francisella tularensis subsp.novicida reflects bacterial colonization,dissemination,and replication coordinated with tick feeding[J].Infection and immunity,2011,79(12): 4941-4946.

[11] Kocan K M,Stiller D,Goff W L,etal.Development of Anaplasma marginale in male Dermacentor andersoni transferred from parasitemic to susceptible cattle[J].American journal of veterinary research,1992,53(4): 499-507.

[12] 侯雨豐，高東旗.斑點熱的主要宿主和媒介[J].醫(yī)學(xué)動物防制，2002,18(8)：447-449.

[13] 張金鑒.談?wù)劥竽c桿菌[J].赤腳醫(yī)生雜志,1979(5)：35.

[14] 李凡，徐志凱.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:184.

[15] De Silva A M,Fikrig E.Growth and migration of Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks during blood feeding[J].The American journal of tropical medicine and hygiene,1995,53(4): 397-404.

[16] Muyzer G,de Waal E C,Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes conding for 16S rRNA[J]，Applied & Environmental Microbiology,1993,59(3):695-700.

DGGE identification ofmicroflorain the saliva fromRhipicephalusmicroplus

XIANG Liang-liang , TANG Huan , CHENG Tian-yin

(College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

To study bacterial communities present in saliva ofRhipicephalusmicroplus(B.microplus). The bacteria in saliva which was collected from partially engorged female adult ticks or fully engorged female adult ticks were analysed with the denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE). It showed that the microbial number and population structure in the saliva from the fully engorged ticks were more different than that from the partially engorged. Fully engorged tick more than partially engorged about two species of bacteria.They Were affiliated withMoraxellaceaebacterium andAcinetobactercalcoaceticusMicrobial in saliva from ticks significantly differed from that in their whole body,and no matter they were partially engorged or fully engorged. Most of bacteria detected in this study were known to be pathogenic.Thus the individual is bitten by theRhipicephalusmicroplusmight develop multiple bacteria disease.

DGGE ;Rhipicephalusmicroplus; saliva ; bacteria Corresponding author：CHENG Tian-yin

2016-03-04

國家自然科學(xué)基金(31372431)

向亮亮(1989-)，男，碩士，主要從事蜱及蜱傳病研究，E-mail:liangliangxiang@hotmail.com

程天印，E-mail:hn5368@163.com

S852.7

A

0529-6005(2017)03-0003-03