益脾養肝方對大鼠肝癌前病變病理形態和脾臟T細胞亞群的影響*

郭英君 郭英 魏海梁 馮飛雪 李京濤 閆曙光 郭輝 常占杰

1.寧夏回族自治區人民醫院 (寧夏 銀川, 750001) 2.陜西中醫藥大學附屬醫院 3.陜西中醫藥大學

肝癌的形成通常要經過“肝炎-肝硬化-肝癌”三個階段，而在肝硬化到肝癌的演進過程中，存在一個比較長的癌前病變階段[1]，若能及時阻止此階段的惡性進展，就有可能阻止肝癌的發生，但目前西醫缺乏有效的治療藥物。中醫藥抑制腫瘤的作用可能弱于化學藥物，但是在調節人體機能方面具有優勢。我們前期研究發現益脾養肝方(YPYGF)具有抗肝癌癌前病變的效果[2,3]，研究的初步結果顯示其主要通過抗癌前病變細胞增殖(PCNA)和抗氧化損傷(GGT)方面起作用[4]。本實驗擬從免疫調控方面，進一步探討YPYGF對肝癌癌前病變大鼠肝臟病理形態和脾臟組織T細胞亞群的影響，為YPYGF治療肝癌癌前病變提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取SPF級Wistar雄性大鼠80只，體質量為180～220g，均購于第四軍醫大學實驗動物中心(許可證號：SCXK(軍)-2012-0007)，飼養在陜西中醫藥大學實驗中心，飼養室溫(23±2)℃、相對濕度(50±5)%，實驗動物自由進食水，適應性飼養1周后進入實驗。

1.2 實驗試劑和藥品 益脾養肝方(按成人每日劑量：白花蛇舌草、白術、黨參各30g、、鱉甲、枸杞、半枝蓮各15g，郁金、姜黃、熟地各10g)，由陜西中醫藥大學藥劑科購買并制備成凍干粉，每1克凍干粉含生藥5g,4℃冰箱密封保存，需要時以100℃沸水溶解，配制成大劑量濃度為1.0g/ml、小劑量濃度為0.5g/ml的中藥藥液。CD3+、CD4+和CD8+一抗以及二抗均購自美國BD公司；0.95g/ml 二乙基亞硝胺(DEN)購自美國Sigma公司；

1.3 動物分組、造模及給藥方法 所有大鼠適應性喂養1周后進行實驗，按隨機數字表法隨機分為空白組、模型組、YPYGF大、小劑量組，每組20只。除空白組以外其余各組腹腔注射DEN(0.5ml/100g)，2次/周(即1次/84h)，連續造模給藥至16周；YPYGF小、大劑量組按10ml/kg分別以中藥灌胃(0.5g/ml，1.0 g/ml)，每日一次；同時，空白組、模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，第16周處死大鼠。

1.4 取材及指標測量 第16周灌胃24h后稱重，10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g)麻醉，心臟取血3ml，于陜西中醫藥大學附屬醫院生化檢驗科檢測肝功能指標；處死大鼠后再解剖腹腔，于肝左葉、右葉、尾葉取材，將其置于10%甲醛溶液固定，常規HE和Masson染色，光鏡觀察；同時，取1/2脾臟組織制備冰凍切片，免疫熒光染色觀察CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群變化。

1.5 脾臟組織免疫熒光檢測 OCT包埋脾臟后液氮冰凍；切6μm組織切片；丙酮固定3min，PBS泡洗5min；晾干，加50-100μl封閉液覆蓋組織，室溫避光封閉2-3h；甩干，加相應的抗體，避光，4℃過夜；PBS泡洗3次，15min/次，加二抗室溫孵育2小時；抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件處理實驗數據，以方差分析進行組間比較，方差齊者采用單因素方差分析中LSD進行檢驗，方差不齊者采用Tamhane’sT2檢驗，P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝功能變化情況 見表1。

表1 各組大鼠肝功能結果比較

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 各組大鼠肝臟組織病理情況 肉眼觀察，模型組大鼠肝臟表面散在分布大小不均淡黃色顆粒狀結節，肝臟邊緣不整齊；而YPYGF大小、劑量組均較模型組明顯好轉。HE染色示：模型組肝組織有大量假小葉的形成，肝臟組織結構混亂，匯管區可見微膽管，動、靜脈大量增生并向肝竇內浸潤，肝竇間隙變小，伴炎性細胞聚集，可見細胞水腫、脂肪變性和異性增生灶，伴有異型增生和結節形成；同時，可見細胞胞核呈分葉狀伴偏移，核質比增大；YPYGF大小劑量組較大鼠模型組肝臟病理形態顯著改善，異性增生灶明顯較少，較少出現脂肪變、水腫壞死區，假肝小葉相對較少，肝細胞核分裂相減少，核質比相對降低，炎性細胞向匯管區和肝竇內的浸潤顯著減少。Masson染色示：模型組大鼠肝臟組織中可見大量纖維條索將肝臟組織分割形成假小葉，而YPYGF大小劑量組纖維條索明顯減少，肝臟分隔減少，且大劑量組比小劑量組更明顯。

2.3 各組大鼠脾臟組織T細胞亞群情況 與空白組比較，模型組大鼠脾臟組織T細胞亞群CD3+、 CD4+T表達陽性區域顯著減少，CD8+T細胞的陽性區域數目增加；與模型組比較，益脾養肝方組大鼠脾臟組織T細胞亞群CD3+、CD4+表達陽性區域數目增長，CD8+則降低。提示益脾養肝方可能通過調節大鼠肝癌前病變脾臟組織CD3+、CD4+和CD8+T細胞數目的異常，從而發揮抗肝癌前病變的作用。

3 討論

肝癌癌前病變在祖國傳統醫學中并沒有明確的概念，多以肝癌發生后患者的臨床表現來命名，如“臌脹”、“積聚”、“黃疸”等。中醫學強調“未病先防，既病防變”，在肝硬化向肝癌惡性轉變的過程，應用有效的單味中藥、復方制劑以及提取物進行綜合治療，起到延緩、阻止甚或逆轉肝癌癌前病變的惡性轉變。

肝癌的形成主因本虛標實，而正氣虧虛導致臟腑陰陽失調，毒邪凝結不祛，日久虛、瘀、毒互結為有形實邪，更致病情加重。現代醫學認為：機體免疫功能降低，會失去對周圍環境的適應性調節能力，進而導致組織結構、功能發生病理性改變，導致肝炎病毒、內毒素等有機可乘，侵犯人體導致疾病的發生；同時，免疫細胞因為被破壞、消耗，更失去了對腫瘤細胞的免疫監視和清除能力，從而導致肝硬化、肝癌的形成[5,6]。益脾養肝方是我科沿用多年的防治肝硬化進展的臨床常用方，該方以黨參、白術、熟地、枸杞健運脾胃、補養肝腎，先天、后天得養，機體御邪之力倍增；半枝蓮、白花蛇舌草解毒散結抗癌；郁金行氣化瘀，姜黃合鱉甲，散瘀行氣，消積散結，以上諸藥共奏益脾養肝，解毒散結之功。藥理研究發現：白術揮發油具有促進胃腸蠕動的功效[7]，也可調節免疫抑制動物模型T細胞亞群分布失調狀態，使 Th淋巴細胞表達上調，Th/Ts比例升高，促進 IL-2的分泌和 Th-R2的表達[8]；黨參提取物可提高免疫抑制小鼠NK細胞活性、B淋巴細胞和T淋巴細胞增殖能力，同時可拮抗CXT誘發的脾臟萎縮、白細胞減少等不良反應[9]；枸杞多糖可顯著抑制H22荷瘤小鼠腫瘤細胞的增殖，增加胸腺、脾臟的指數，進一步增強細胞免疫和體液免疫功能，上調血清中IL-2、TNF-α的表達，從而通過免疫增強途徑實現對腫瘤的抑制效應[10]；熟地黃可促進免疫損傷小鼠效應記憶性T細胞(TEM)比例下降和Th細胞亞群比例失衡的盡早恢復，有利于免疫功能的重建[11]；半枝蓮多糖可顯著促進移植性H22肝癌小鼠胸腺、脾臟重量和單核細胞的吞噬指數，提高IL-2的表達，發揮免疫調節和抗腫瘤作用[12]；白花蛇舌草聯合半枝蓮可增加晚期非小細胞肺癌患者治療效果，調節T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+表達及CD4+/CD8+的比例[13]。

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