ABCC10在浸潤性乳腺癌中的表達及耐藥研究

陳 飛, 路 選, 王 穎

(揚州大學附屬醫院, 江蘇 揚州, 225001)

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ABCC10在浸潤性乳腺癌中的表達及耐藥研究

陳 飛, 路 選, 王 穎

(揚州大學附屬醫院, 江蘇 揚州, 225001)

乳腺癌; 化療; 耐藥

乳腺癌最重要的全身治療手段之一就是化療，但化療的療效往往由于腫瘤細胞對化療藥物的耐藥而降低，所以研究清楚乳癌細胞對化療耐藥的原因則顯得尤為重要，目前的研究著重于腫瘤耐藥基因及其相關蛋白[1]。研究[2]表明ABC家族膜轉運體在導致腫瘤細胞耐藥的過程中扮演著重要的角色，ABC膜轉運蛋白家族即ATP結合盒(ABC)膜轉運蛋白家族，其耐藥機制為通過膜轉運蛋白，把化療藥物從細胞內轉運至細胞外，細胞內化療藥物濃度減小，對腫瘤的殺傷能力減少，從而造成耐藥。ABC家族的一個亞家族(C族)也稱為多藥耐藥相關蛋白(MRP)家族，人類ABCC10(MRP7)是MRP家族最新發現的成員[3]。但ABCC10與乳腺癌的關系研究甚少，本研究探討乳腺癌中ABCC10的表達以及對常見乳癌化療藥物的耐藥，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源

收集2014年11月—2015年11月本院乳腺外科浸潤性乳腺癌組織手術切除標本及相應正常組織55例。患者平均年齡( 56.13±8.70)歲，中位年齡61歲。其中髓樣癌3例，黏液癌1例，浸潤性導管癌51例，手術前患者均未行化療或放療。術后即刻將標本置于預先盛有無菌RPMI1640 培養液的無菌管中，部分新鮮癌組織用于化療藥物藥敏試驗，將相應標本用10%甲醛固定，經脫水、透明，常規石蠟包埋。由病理科經驗豐富醫師進行癌組織病理分類、分級診斷，術后進行TNM 分期。

1.2 試劑

ABCC10兔抗人多克隆抗體及二抗購自上海昕浩生物科技有限公司，RPMI1640、胎牛血清購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶和購自Thermo Fisher公司，紫杉醇、多西他賽購自揚子江藥業，表阿霉素、環磷酰胺、吉西他濱、長春瑞濱分別購自輝瑞制藥有限公司、德國BAXTER ONCOLO公司、江蘇豪森藥業、吉林一心藥業公司。MTT和DMSO購自Sigma公品。免疫組化試劑盒購自美國Gene Tec公司。

1.3 方法

1.3.1 癌組織藥物敏感實驗: 將新鮮癌破碎，反復沖洗勻漿，用尼龍膜過濾破碎的組織液，用RPMI1640完全培養液調整組織液中細胞濃度到105/mL，臺盼藍染色計數；將細胞懸液接種于96孔培養板，190 μL/孔，分空白組、對照組和實驗組(實驗組包括高濃度和低濃度組)，每組設4個復孔；在37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h, 分別加入上述各種化療藥10 μL, 使高濃度組的終濃度為人體血藥濃度。陰性對照孔和空白孔加10 μL RPMI 1640，培養48 h后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL, 接著培養4 h。去上清，每孔加入DMSO 150 μL, 使之混勻，培養板振蕩10 min, 使孔中沉淀完全溶解。置于酶標儀，讀取波長570 nm處各孔吸光度值。

1.3.2 ABCC10蛋白檢測: 標本石蠟包埋后，經5 μm連續切片，分別做HE和免疫組化染色。免疫組化染色采用兩步法: 切片脫蠟至水，尿素消化，3%過氧化氫封閉，用檸檬酸緩沖液進行微波加熱煮沸進行抗原修復，冷卻至室溫，加兔血清孵育，加一抗(1︰200) 4 ℃ 過夜后，取出37 ℃ 復溫, PBS 沖洗3次，每次5 min, 加入山羊二抗(En Vision), 37 ℃恒溫反應(中間各步用PBS 洗)，加DAB 顯色，用蘇木精輕微復染，脫水、透明及封片，在光鏡下觀察。對照組設正常組織和空白(以PBS代替一抗)對照。

1.4 判定標準

以IR數值作為藥物敏感性的判斷標準,IR<30%為耐藥, 31%～50%低度敏感，51%～70% 為中度敏感，>70%高敏[4]。藥物抑制率(IR)=(對照組OD值-藥物組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。免疫組化結果判定: 以細胞膜及胞質中出現均勻一致的棕黃色顆粒為ABCC10陽性細胞，在400倍的光學顯微鏡下，每例均隨機選取5個視野，用二級計分法計算結果，取平均值。陽性細胞比得分(5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分, 51%～75%為3分, >75%為4分)乘以染色強度得分(淡黃色為1分，黃色及深黃色為2分，褐色及深褐色為3分)，結果0分為陰性(-), 1～4分為弱陽性(+), 5～8分為中度陽性(2+)，9～12分為強陽性(3+) 。

1.5 統計學方法

采用非參數檢驗的方法對癌組織的組織學類型TNM分期以及病理分級進行單因素分析。癌組織耐藥性試驗結果與其相應組織ABCC10表達進行Spearman秩相關檢驗，以rs表示秩相關系數。使用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。

2 結 果

2.1 免疫組化結果和ABCC10 的表達與臨床病理因素的關系

免疫組化結果顯示, ABCC10陽性表達主要定位于胞膜上和胞質中。陽性表達率為67.3%, 不同病理分級、TNM分期之間ABCC10的表達差異均有統計學意義(P<0.05); 病理分級、TNM分期越高, ABCC10表達的陽性率越高。見表1。

2.2 化療藥物敏感性檢測結果與ABCC10表達的相關性

浸潤性乳腺癌組織對6種常見化療藥物的耐藥性檢測結果與其相應組織中ABCC10的表達做相關性分析，見表2。

表1 乳癌組織中ABCC10的表達與臨床病理因素的關系

表2 ABCC10 在乳腺癌表達與藥物敏感相關性

3 討 論

目前乳腺癌的治療，包括局部治療和全身治療，既要求標準化，又強調與個體化，其中化療是乳腺癌全身治療的重要組成部分。研究證明多藥耐藥(MDR)成為化療失敗的重要原因。MDR, 即腫瘤細胞一旦對一種抗癌藥物產生耐藥，就可能對非同一類型的多種結構、細胞靶點和作用機制迥然不同的藥物也產生耐藥。耐藥相關標志與治療藥物或化療方案密切相關且非常復雜[4-5]。研究發現ABC家族介導的藥物外排在MDR中起了重要作用，人類 ABCC10是新近發現的 ABC 家族成員。研究[6-8]表明ABCC10的水平不但能夠影響腫瘤的生物學行為，也可以調節多種化療藥物對惡性腫瘤細胞的敏感性，其主要的作用機制是使得細胞內化療藥物外排[9]。在對肺癌、頭頸部惡性腫瘤的研究中，都看到了類似的結果[10-11], 但ABCC10在乳腺癌中的研究甚少。

本實驗運用免疫組化法證明了ABCC10在乳腺癌組織中有過表達現象, ABCC10在陽性表達率為67.3%, 不同病理分級、TNM分期之間ABCC10的表達差異均有統計學意義(P<0.05), 并且組織學分級、TNM分期越高, ABCC10表達的陽性率越高。提示ABCC10 與乳腺癌的惡性程度，有一定的相關性，可能與乳腺癌的發生、發展過程具有某種聯系。

[1] 趙宇斌, 張少華, 王金清, 等. 乳腺癌組織EphA2和EphrinA1蛋白表達及臨床意義的探討[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2011, 18(7): 513-516.

[2] Kruh G D, Belinsky M G. The MRP family of drug efflux pumps[J]. Oncogene, 2003, 22(47): 7537-7552.

[3] Kao H H, Chang M S, Cheng J F, et al. Genomic structure, gene expression, and promoter analysis of human multidrug resistance-associated protein 7[J]. J Biomed Sci, 2003, 10(1): 98-110.

[4] Jian H J, Jin Q C, Long Y J, et al. Breast cancer resistance protein expression and 5-Fluorouracil resistance[J]. Bio Envir Sci, 2008, 21(2): 290-295.

[5] Rodrigues F F, Santos R E, Melo M B, et al. Correlation of polymorphism of the MDR-1 gene and the response of primary chemotherapy in women with locally advanced breast cancer[J]. Genet Mol Res, 2008, 7(1): 177-183.

[6] Domanitskaya N, Wangari-Talbot J, Jacobs J, et al. Abcc10 status affects mammary tumour growth, metastasis, and docetaxel treatment response[J]. British journal of cancer, 2014, 111(4): 696-707.

[7] Kathawala R J, Wei L, Anreddy N, et al. The small molecule tyrosine kinase inhibitor NVP-BHG712 antagonizes ABCC10-mediated paclitaxel resistance: a preclinical and pharmacokinetic study [J]. Oncotarget 2015, 6(1): 510-521.

[8] Wijnholds J. Drug resistance caused by multidrug resistance-associated proteins [J]. Novartis Foundation symposium, 2002, 243: 69-79, 80-62, 180-185.

[9] Huang Y, Sadee W. Membrane transporters and channels in chemoresistance and sensitivity of tumor cells [J]. Cancer Lett, 2006, 239( 2): 168-182.

[10] 王鵬, 張志培, 王小平, 等. 非小細胞肺癌組織ABCC10的表達及其與耐藥相關性的研究[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2010, 17(8): 605-608.

[11] Naramoto H, Uematsu T, Uchihashi T, et al. Multidrug resistance associated protein 7 express ion is involved in cross-resistance to docetaxel in salivary gland adeno carcinoma cell lines[J]. Int J Oncol, 2007, 30( 2): 393-401.

2016-11-23

R 737.9

A

1672-2353(2017)05-177-02

10.7619/jcmp.201705059