TLR7基因單核苷酸多態性與食管癌易感性的相關性研究

毛渭東, 周智輝, 張艷梅

(1. 陜西省漢中市中心醫院 病理科, 陜西, 漢中, 72300;2. 上海同濟大學 免疫學教研室, 上海, 200092;3. 陜西省榆林市第二醫院 檢驗科, 陜西, 榆林, 719000)

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TLR7基因單核苷酸多態性與食管癌易感性的相關性研究

毛渭東1, 周智輝2, 張艷梅3

(1. 陜西省漢中市中心醫院 病理科, 陜西, 漢中, 72300;2. 上海同濟大學 免疫學教研室, 上海, 200092;3. 陜西省榆林市第二醫院 檢驗科, 陜西, 榆林, 719000)

目的 本研究旨在探討toll樣受體7基因(TLR7)3′端非編碼序列microRNA-1265(miR-1265)結合位點單核苷酸多態性rs72552316與食管癌易感性的關系。方法 采用單中心為基礎的病例對照研究。在這項研究中，聚合酶鏈反應(PCR)和直接測序被用于204食管癌病例和200例健康對照TLR7基因分型。rs72552316影響miR-1265對TLR7蛋白表達的調控由免疫組化法檢測。結果 與攜帶野生型純合子AA基因型比較，攜帶rs72552316的GG基因型個體患食管癌的風險增加(OR=2.180, 95%CI=1.152-4.127,P=0.019)。此外，在食管癌組織中檢測TLR7的表達，這表明TLR7蛋白水平可能與SNP rs72552316相關。結論 Toll樣受體7基因3?端非編碼序列miR-1265結合位點單核苷酸多態性rs72552316與食管癌易感性相關。miR-1265/TLR7軸可能在食管癌的發生發展中起重要作用。

食管癌; Toll樣受體7; 多態性

食管癌是一種侵襲性惡性腫瘤，據統計[1], 2014年食管癌在中國常見惡性腫瘤中排第6位。食管癌包括2個主要組織學類型：食管鱗狀細胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)。食管鱗狀細胞癌是食管癌的最常見的組織學亞型，占食管癌病例的90%以上[2]。大量研究[3]發現，暴露于相同環境風險因素中，僅僅只有一部分人員會發展為食管癌，這提示大量基因在食管癌癌變中起重要作用，遺傳多態性或許可以解釋食管癌易感性中存在的個體差異。Toll樣受體(TLR)是通過先天免疫細胞中表達的跨膜模式識別受體觸發，通過控制不同的信號通路激活先天免疫應答[4]。除了微生物配體，這些受體也觸發針對內源性配體，包括MSU晶體的先天免疫應答[5]。迄今共有10個不同功能的人類的TLR(TLR1-10)被確定[6], 其中TLR7是一個典型成員，已被證明與若干自身炎性疾病相關聯[7]。TLR激活核因子κB(NF-κB)途徑，主要調控炎癥信號傳導途徑，這種活化參與多種腫瘤的發病機制[8]。本研究探討在中國漢族人群中, TLR7基因microRNA結合位點單核苷酸多態性與食管癌易感性的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012年7月—2015年6月共納入就診于本院的食管鱗狀細胞癌患者204例，平均年齡(56.3±8.3)歲，其中男124例，女80例。所有患者均經過胃鏡或手術取得組織標本，經2位病理科醫師診斷為食管鱗癌。所有患者均未接受化學治療或放射治療，經醫師檢查排除罹患其他系統腫瘤。選取與病例組患者同期健康體檢者200例作為對照組，平均年齡(57.8±7.9)歲; 男125例，女75例。食管癌病例組與正常對照組在年齡、性別比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。對ESCC病例組及健康對照組人群吸煙和飲酒情況進行問卷調查，根據WHO相關標準，凡每次飲酒酒精量達50 g以上，每周飲酒1次以上，視為飲酒; 每天吸煙1支以上，連續3月以上，視為吸煙。所有受試者均為漢族。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取：每位受試者采集外周靜脈血5 mL, 基因組DNA提取試劑盒QIAamp DNA Blood Mini Kit購自QIAGEN公司，操作按照試劑盒說明書進行，提取的基因組DNA置于-20℃保存，用做后續PCR實驗模板。

1.2.2 基因型分析 PCR反應體系: Taq DNA聚合酶(大連寶生物公司)0.25 μL, 不含Mg的10×PCR緩沖液5 μL, MgC12(25 mol/L)5 μL, dNTP(10 mol/L)0.5 μL, 上游引物(5-ATC CTG GCT GAC TCC TTC TT-3 )、下游引物(5-TCCTCT AGT AAT GAT GCT GAC AAT-3 )各1 μL, 模板DNA 2 μL, 雙蒸水補至50 μL; 反應條件: 94 ℃ 3 min, 94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s循環30次, 72 ℃ 10 min; 產物大小為996 bp。PCR產物經2%瓊脂糖電泳后，采用PCR產物純化回收試劑盒(北京天根生化公司)回收目的條帶，采用美國ABI3730測序列分析儀進行基因型分析。

1.2.3 免疫組化分析：免疫組化(IHC)按照之前的方法操作[9], 試劑盒購自武漢博士德公司。

1.3 統計學處理

本研究所有數據分析采用SPSS17.0統計軟件包進行。Hardy-Weinberg平衡檢驗采用卡方檢驗方法; 食管癌組與對照組患者性別、年齡、吸煙習慣、飲酒習慣及腫瘤家族史的差異采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義; 非條件Logistic回歸方法分析食管癌組與對照組人群中的基因型與食管癌的發病風險，即比值比(OR值)及其95%置信區間(95%CI)。

2 結 果

2.1 受試者一般資料

食管癌組男124例，女80例; 年齡<60歲63例, ≥60歲141例; 吸煙88例，飲酒83例; 有腫瘤家族史者27例。健康對照組男125例，女75例; 年齡<60歲57例, ≥60歲143例; 吸煙63例，飲酒61例; 有腫瘤家族史者13例。2組年齡和性別比例差異無統計學意義(P>0.05)。食管癌組吸煙者、飲酒者及有腫瘤家族史者比例高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 遺傳平衡檢驗

卡方檢驗結果提示，食管癌組與對照組群體中TLR7基因399位點基因型分布，符合Hardy-Weinberg平衡，說明所選取的研究對象具有群體代表性。

2.3 TLR7基因型分布與ESCC易感性的關系

食管癌和對照組基因型頻率見表1。食管癌組GG型比例高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。非條件Logistic回歸分析顯示，相對于AA基因型(野生型), GG基因型(變異型)可增加個體罹患ESCC的風險(OR=2.180, 95%CI=1.152～4.127,P=0.019)。而AG基因型在ESCC發生風險上差異無統計學意義。具體地說，相較于A等位基因，攜帶G等位基因的個體罹患胃癌的風險升高(OR=1.360, 95%CI=1.022～1.811,P=0.035)。

表1 TLR7基因型分布與ESCC易感性之間的關系

2.4 TLR7基因型與TLR7表達

利用在線工具miRNASNP(http: //www. bioguo. org/miRNASNP/), 發現TLR7基因3′端非編碼序列存在一個單核苷酸多態性，可能影響microRNA與TLR7的結合(圖1)。進一步評估不同基因型患者TLR7表達的臨床意義，免疫組織化學染色(圖2、3)表明，與AA基因型相比，TLR7在GG基因型ESCC患者中有更高的表達。

圖1 TLR7基因型

圖2 TLR7在ESCC患者AA基因型中的表達免疫組化染色EnVsion法高倍放大

3 討 論

近年來，盡管在食管癌的診斷和治療方面取得顯著進展，但是食管癌的5年生存率無明顯提高，究其原因在于患者就診時往往處于晚期，這表明需要發現新的生物學標記早期診斷食管癌。本研究探討TLR7的SNP RS3775291對食管癌易感性可能造成的影響。本研究進行了中國人口的前瞻性觀察研究，回歸分析結果提示, rs3775291是食管癌的獨立危險因素。

圖3 TLR7在ESCC患者GG基因型中的表達免疫組化染色EnVsion法高倍放大

關于TLR基因單核苷酸多態性與腫瘤的相關性研究，國內外均有大量報道，但結果不盡相同。Shen等[10]探討了Toll樣受體4基因多態性與膀胱癌易感性的關系發現，相對于GG基因型個體, -729GC基因型受試者患膀胱癌的風險明顯升高(OR=2.50, 95%CI為1.39～4.48,P=0.002)。Li等[11]報道, TLR4-2081G/A多態性與胃癌易感性成負相關。本研究發現, TLR7基因rs72552316位點基因型頻率(A/A、A/G+G/G)在病例組的分布分別為92.31%、7.69%; 在對照組的分布分別為83.64%、16.36%。等位基因頻率A和G在病例組和對照組的分布分別為95.45%、4.55%; 91.21%、8.79%, 基因型和等位基因頻率在2組的分布差異均有統計學意義。攜帶突變基因G的個體發生食管癌的危險是等位基因A的1.365倍，提示攜帶等位基因G可升高患食管癌的發病風險。

microRNA是一類內源性非編碼小RNA, 長度大約22個核苷酸，其功能是作為轉錄后基因表達的負性調節因子。成熟miRNA通常通過結合到靶基因mRNA3'非編碼序列(3′UTR), 從而導致mRNA的降解或翻譯的抑制。一些研究表明，一些microRNA與腫瘤的發生相關。在3′非編碼區的miRNA結合位點的基因多態性可以影響的miRNA的目標識別和miRNA的調控功能。多項研究已經探討miRNA結合位點核苷酸多態性(SNP)與腫瘤風險的相關性。Zheng等[12]報道, Toll樣受體4miR-34a結合位點的單核苷酸多態性與肝癌的易感性相關。Cheng等[13]發現, TLR7microRNA結合位點單核苷酸多態性rs72552316與乳腺癌易感性相關。但是, microRNA單核苷酸多態性與癌癥的易感性的關系并未完全了解[14-21]。本研究發現, Toll樣受體7miR-1265結合位點的單核苷酸多態性rs72552316影響食管癌患病風險[22-26]。

總之，本研究探討TLR7基因多態性與食管癌易感性之間的關系，提示了該TLR7 SNP RS3775291可能是食管癌一個風險因素。

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Correlation between single nucleotide polymorphisms of TLR7 gene and susceptibility to esophageal cancer

MAO Weidong1, ZHOU Zhihui2, ZHANG Yanmei3

(1.DepartmentofPathology,HanzhongCentralHospital,Hanzhong,Shaanxi, 723000;2.DepartmentofImmunology,TongjiUniversity,Shanghai, 200092; 3.DepartmentofClinicalLaboratory,YulinSecondHospital,Yulin,Shaanxi, 719000)

Objective To investigate the relationship of a functional variant (rs72552316) at microRNA-1265 (miR-1265) binding site in toll-like receptor 7 gene and the risk of esophageal cancer. Methods A single center-based case-control study was conducted. In this study, the polymerase chain reaction (PCR) and direct sequencing were used for genotype sequence variants of TLR7 in 204 esophageal cancer cases and 200 controls. The modification of rs72552316 on the binding of miR-1265 to TLR7 protein was measured by Immunohistochemistry assay. Results Individuals carrying the GG genotypes for the rs72552316 were associated significantly with increased risk of esophageal cancer comparing with those carrying wild-type homozygous CC genotypes (OR=2.180, 95%CI=1.152-4.127,P=0.019). Furthermore, the expression of TLR7 was detected in the esophageal cancer tissue, suggesting that protein levels of TLR7 might be associated with SNP rs72552316. Conclusion Risk of esophageal cancer was associated with a functional variant at miR-1265 binding site in toll-like receptor 7 gene. miR-1265/TLR7 axis may play an important role in the development of esophageal cancer.

esophageal cancer; toll-like receptor 7; polymorphisms

2016-11-25

R 735.1

A

1672-2353(2017)05-102-04

10.7619/jcmp.201705028