RAD50, IL-33和IL1RL1基因與漢族人群過敏性哮喘發病的相關性

陳杰斌, 張 潔, 胡浩忠, 金英姬, 薛 梅

(江蘇省泰州市人民醫院 兒科, 江蘇 泰州, 225300)

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RAD50, IL-33和IL1RL1基因與漢族人群過敏性哮喘發病的相關性

陳杰斌, 張 潔, 胡浩忠, 金英姬, 薛 梅

(江蘇省泰州市人民醫院 兒科, 江蘇 泰州, 225300)

目的 探討CDHR3, GSDMB, IL-33, RAD50和IL1RL1等基因多態性位點與漢族人群過敏性哮喘及其嚴重程度的相關性。方法 研究共納入516例兒童過敏性哮喘患者和552例健康對照人群。對上述5個基因等多態性位點進行基因分型，包括CDHR3的rs6967330, GSDMB的rs2305480, IL-33的rs928413, RAD50的rs6871536和IL1RL1的rs1558641。比較患者組和對照組基因型和等位基因頻率。分析基因型與臨床表型包括FEV1%和總IgE的關系。結果 與對照組相比，患者組有顯著較高頻率的rs928413等位基因G和rs6871536等位基因C(P<0.001)。患者組較正常對照組有顯著降低的rs1558641等位基因G (P=0.007)。相比與其他基因型，患者rs928413基因型GG和rs1558641基因型GG與低FEV1%和高水平的血清總IgE有顯著相關性。結論 IL-33，IL1R1和RAD50基因與中國人群的哮喘風險相關。

哮喘; 基因多態性; 中國人群

哮喘是兒童最常見的慢性疾病之一，臨床主要表現為氣喘、呼吸短促和氣道黏膜的慢性炎癥[1-2]。哮喘患者可伴有不可逆的氣道重塑和氣流限制[3-4]。 目前輕度哮喘存在一些有效的治療方法，而嚴重哮喘仍難以控制[5]。哮喘家系的存在表明遺傳因素是哮喘病因的重要組成。目前的觀點是遺傳和環境因素相互作用共同導致哮喘發展和演變[6-9]。最早的雙胞胎研究[10-11]證實了遺傳因素可影響哮喘發展。全基因組關聯研究[12-13]確定多個染色體位點與哮喘相關。許多研究[14-17]對候選基因變異和哮喘的風險的相關性進行了報道，并提出了許多易感基因。作為一個強大的研究復雜疾病遺傳結構的工具，哮喘的全基因組關聯研究(GWAS)已確定了染色體上幾個主要的易感區域，如ORMDL3-GSDMB區域、TSLP-WDR36區域和HLA-DR/DQ區域[21]。此外，一些位點研究呈現與哮喘表型相關，如支氣管高反應性和高免疫球蛋白E(IgE)的表達水平[22-23]。最近一次的嚴重哮喘GWAS研究[24]發現了5個易感基因，包括CDHR3、GSDMB、IL-33、RAD50和IL1RL1[5, 19]。目前在中國人群中仍不確定哮喘和這5個易感基因的相關性。本研究探討CDHR3、GSDMB、IL-33、RAD50和IL1RL1等基因多態性位點與漢族人群過敏性哮喘及其嚴重程度是否存在相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在本單位倫理委員會的批準下，作者回顧了2009年1月1日—2015年3月31日本院治療的867例兒童哮喘患者。哮喘診斷根據中華兒科雜志2008年修訂的兒童支氣管哮喘診斷與防治指南: ① 反復發作喘息、咳嗽、氣促、胸悶，多與接觸變應原、冷空氣、物理、化學性刺激、呼吸道感染、運動以及過度通氣(如大笑和哭鬧)等有關，常在夜間和(或)凌晨發作或加劇。② 發作時雙肺可聞及散在或彌漫性，以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長。③ 上述癥狀和體征經抗哮喘治療有效，或自行緩解。④ 除外其他疾病所引起的喘息、咳嗽、氣促和胸悶。⑤ 臨床表現不典型者(如無明顯喘息或哮鳴音)，應至少具備以下1項：支氣管激發試驗或運動激發試驗陽性; 證實存在可逆性氣流受限。支氣管舒張試驗陽性：吸入速效β2受體激動劑(如沙丁胺醇壓力定量氣霧劑(200～400 μg)后15 min第1秒用力呼氣量(FEV1)增加≥12%。抗哮喘治療有效：使用支氣管擴張劑和口服(或吸入)糖皮質激素1～2周, FEV1增加≥12%; 最大呼氣峰流量(PEF)日間變異率(連續監測1～2周)≥20%。符合第1～4條或第4、5條者，可診斷為哮喘。同時根據美國國立衛生研究院的臨床標準確認。本研究入選標準如下: ① 年齡為5～18歲; ② 過敏性哮喘，其定義為對7種常見過敏原表現為皮膚劃痕試驗反應陽性，或任一特定IgE過敏原濃度>0.35 kU/L。其他慢性炎性疾病患者被排除在本研究之外。最后, 516例兒童過敏性哮喘患兒被納入研究，設為患者組。對照組為552例健康兒童，均不伴有呼吸道疾病史，或其直系親屬中有哮喘病人。所有對照組均有一個陰性的皮膚劃痕實驗。所有的研究對象均為中國漢族人群，監護人均簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

每個病人均提取血液樣本以分析總IgE和特異性IgE水平。利用酶免疫法測定血清內下列抗原特異性IgE水平，包括草、塵螨、貓、狗或樹過敏原，所得值在分析前進行對數處理。每位受試者進行3次肺功能測試，以3個記錄值中最佳者為基礎肺功能值。用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣量(FEV1)及FEV1/FVC比例亦進行相應計算。肺功能最終結果以其與根據性別、身高和年齡預測的正常值的比例為準。

實驗對象的DNA利用標準試劑盒內提供的實驗流程提取。既往文獻中以下5個單核苷酸多態性位點被報道與兒童哮喘顯著相關[24], 包括位于7號染色體CDHR3基因的rs6967330(G/A), 位于17號染色體GSDMB基因的rs2305480(G/A), 位于9號染色體IL-33基因的rs928413(A/G), 位于5號染色體RAD50基因的rs6871536(T/C)和位于2號染色體IL1RL1基因的rs1558641(G/A)。因此，這5個單核苷酸多態性位點被作為目標位點以研究其與哮喘之間的相關性。利用熒光探針對單核苷酸多態性位點進行基因分型檢測，分型的結果由美國ABI公司的熒光定量qPCR定量儀Step-One-Plus進行分析。20%的樣本被隨機挑選并進行重復驗證以保證基因分型結果的可靠性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0版軟件(美國SPSS公司.芝加哥，伊利諾斯州)分析數據。計算病人和對照組的基因型和等位基因頻率。哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢測患者和對照組的基因頻率分布。利用卡方檢驗分析哮喘患者和對照組之間基因型和等位基因頻率差異。肺功能值FEV1%、FEV1/FVC和總IgE以均數±標準差表述。利用方差分析分析基因型與臨床表型包括FEV1%和總IgE的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

患者組FEV1預測百分比(FEV1%)和FEV1/FVC的值顯著小于對照組(P<0.001)。患者組血清總IgE顯著高于對照組(P<0.001)。見表1。高于0.35 kU/L的特定IgE過敏原的分類見表2。所有研究對象的5個單核苷酸多態性位點均成功進行基因分型。HWE檢驗表明患者組或對照組基因型頻率符合人群分布。2組共有3個單核苷酸多態性位點有明顯不同的等位基因和基因型頻率。與對照組相比，患者組有顯著較高頻率的rs928413等位基因G和rs6871536等位基因C(rs928413為9.5%∶6.2%,P=0.004; rs6871536為26.1%∶19.9%,P<0.001)。此外，患者組較正常對照組有顯著降低的rs1558641等位基因G (17.2%∶21.7%,P=0.007)。而其他2個位點的等位基因和基因型頻率在2組間無顯著差異。見表3。

表1 2組受試者一般資料比較

a實際值/預測值百分比;b對數轉換后數值;

與對照組比較, **P<0.001。

表2 患者特異性抗原值

a患者中特異性抗原>0.35 kU/L的人數。

兩個位點rs928413和rs1558641被發現與FEV1%和血清總IgE顯著相關。患者rs928413基因型GG和rs1558641基因型GG較其他基因型與患者降低的FEV1%顯著相關。此外, rs928413基因型GG和rs1558641基因型GG也與血清總IgE水平升高顯著相關。至于其他3個位點，未發現與哮喘有關的表型有顯著的關聯。見表4。

表3 位點的基因型及等位基因頻率統計

a以最小頻率等位基因為參考計算。

表4 位點基因型與哮喘臨床表型相關性

3 討 論

哮喘的主要特征表現為支氣管黏膜炎癥細胞浸潤[25]。越來越多的證據[26]表明，細胞因子產生的T輔助細胞(TH)在病程中可能發揮關鍵作用。除了經典的TH細胞因子，氣道上皮細胞產生的細胞因子最近被認為是過敏性哮喘的關鍵調控因素[27-28]。先前的研究[13-14, 17]已經報道了哮喘有關的遺傳變異及細胞因子。在這項研究中，作者首次報道IL-33、IL1R1和RAD50基因與中國人群哮喘風險相關聯。

IL-33基因周圍的多態性位點和過敏性哮喘之間的關系已結得到證實[20, 24]。Gudbjartsson等[20]通過GWAS研究首先報道rs1412426的T等位基因與歐洲人群過敏性哮喘的發生顯著相關。在另一個GWAS里[24], IL-33基因的rs928413被確認為早期兒童哮喘易感性位點。與Bonnelykke等[24]的研究結果一致的是，作者發現rs928413等位基因G可令過敏性哮喘的發病風險增加1.6倍。內皮和上皮細胞表達的IL-33可能是上皮損傷后免疫系統分泌的重要內源性信號[29]。IL-33可刺激自然輔助細胞IL-5和IL-13的快速表達，并促進TH2生成和TH2細胞因子的分泌[30]。IL-33與其受體結合被發現可誘導TH2型炎癥反應，并刺激氣道炎癥的產生[31]。在本研究中作者發現, IL-33的rs928413與哮喘患者降低的肺功能及升高的血清IgE顯著相關。作者推測，表達IL-33可表明更嚴重的哮喘癥狀。

不同人群中IL1RL1基因與哮喘的發病風險已經被證實[32-34]。與這些研究結果一致的是，作者也成功驗證了rs1558641與中國人群哮喘的相關性。IL1RL1基因編碼位于TH2細胞和調節性T細胞受體。在之前的文獻中, IL-33和IL1RL1參與同一個信號傳導通路。IL-33可與受體IL1RL1相結合并形成形態與受體復合物[35]。這種受體復合物可通過激活信號蛋白誘發過敏嗜酸性介質的釋放如IL-5和IL-13, 從而導致嗜酸性粒細胞的炎癥反應。在本研究中, IL-33和IL1RL1的兩個位點被發現和哮喘的臨床特征有重大關聯。同樣, Savenije等[34]報道IL-33-IL1RL1通路多態性與哮喘表型相關聯。這些發現有助于基于IL-33-IL1RL1信號通路減少炎癥以達到治療哮喘的效果。

除了IL-33和IL1RL1, RAD50基因多態性也發現與中國人群哮喘的發生有關。Li等[36]在RAD50基因內含子確定3個位點(rs2244012、rs6871536 和rs2897443)與哮喘高度相關。Murk等[37]報道RAD50基因的rs2706347和哮喘風險存在關聯。RAD50基因含所在的基因區域亦包含了IL-5、IL-13和其他與哮喘相關基因[38]。Weidinger等[39]發現RAD50 基因位點與血清總IgE水平有關。在本研究中，作者未發現rs6871536基因型頻率和血清總IgE水平存在關聯。

盡管GSDMB基因的rs2305480和CDHR3基因rs6967330被報道與哮喘易感相關，作者未能在中國人群中驗證。此類型的驗證失敗可能反映了等位基因和基因型頻率受不同種族群體之間的遺傳異質性影響。值得注意的是, rs6967330的最小等位基因頻率在正常中國人群為0.06, 而正常歐洲人群中為0.17。作者并不排除GSDMB和CDHR3基因的其他多態性位點可能與哮喘發病相關，仍需進一步研究證實。

本研究結果顯示, IL-33、IL1RL1和RAD50基因多態性與中國人群的過敏性哮喘相關，并發現IL-33-IL1RL1受體復合物可對哮喘患者的臨床表型有明顯影響。

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Correlation between polymorphisms of RAD50, IL-33 and IL1RL1 and allergic asthma in Han population

CHEN Jiebin, ZHANG Jie, HU Haozhong, JIN Yingji, XUE Mei

(DepartmentofPediatrics,TaizhouPeople′sHospital,Taizhou,Jiangsu, 225300)

Objective To investigate correlation between genetic polymorphisms of CDHR3 (rs6967330), GSDMB (rs2305480), IL-33 (rs928413), RAD50 (rs6871536) and IL1RL1 (rs1558641) and occurrence and severity of allergic asthma in Han population. Methods Genotype and allele frequencies were compared between 516 patients and 552 controls by Chi-square test. Correlation between genotype and FEV1, total IgE was analyzed. Results Compared with the controls, the allergic patients had significantly higher allergic G of rs928413 and allergic C of rs6871536 (P<0.001). Besides, allergic patients were found to have significantly lower frequency of allergic A of rs1558641 (P=0.007). Compared with other genotypes, patients with rs928413 genotype GG and rs1558641 genotype GG were significantly correlated with low FEV1% and high level of serum total IgE. Conclusion Gene IL-33, IL1R1, and RAD50 are correlated with the risk of asthma in Han population.

asthma; genetic polymorphism; Chinese population

2016-12-06

R 562.2

A

1672-2353(2017)05-097-05

10.7619/jcmp.201705027