核苷類似物干預后慢性乙型肝炎患者HBV多聚酶區基因突變模式與危險因素分析

樊正勤, 曹靈芝, 趙 耘, 全 文, 孫正松

(江蘇省揚州市第三人民醫院 江蘇省蘇北人民醫院新區分院, 江蘇 揚州, 225125)

?

核苷類似物干預后慢性乙型肝炎患者HBV多聚酶區基因突變模式與危險因素分析

樊正勤, 曹靈芝, 趙 耘, 全 文, 孫正松

(江蘇省揚州市第三人民醫院 江蘇省蘇北人民醫院新區分院, 江蘇 揚州, 225125)

目的 研究揚州市慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者用核苷類似物治療過程中HBV多聚酶區(P區)發生基因變異的突變模式和危險因素。方法 選取108例接受核苷類似物治療后出現病毒學突破的慢乙肝患者作為研究對象，采用PCR產物直接測序法，分析HBV P區基因變異發生情況。結果 108例患者中, 69例檢測出基因型耐藥，突變類型共計12種，其中rtM204I突變最多見(30.4%), 其次為rtL180M/rtM204I聯合突變(13.0%)。主要核苷類似物耐藥所占比例最高為拉米夫定(62.3%), 其次為阿德福韋酯(21.7%)及替比夫定 (15.9%)。單個位點突變33例, 2個位點突變29例, 3個及以上位點突變7例，其中1例為單用拉米夫定，1例為單用恩替卡韋，其余5例為拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋不規則聯合或序貫使用。結論 HBV P區基因耐藥的氨基酸突變復雜多變，rtM204V/I突變最為常見，3個及以上位點突變與拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋不規則聯合或序貫使用相關。

乙型肝炎; 核苷類似物; 耐藥; 突變

在過去10余年中，慢性乙型肝炎(CHB)治療有了長足的進步，主要歸功于口服核苷和核苷酸類藥物(NAs)在抗病毒治療中的應用。抗乙肝病毒(HBV)治療過程中，隨著治療時間的延長，往往會出現病毒耐藥株，影響抗病毒治療應答[1]。耐藥不僅可導致疾病進展，還會增加治療難度和醫療成本[2]。本文探討揚州市108例CHB患者采用核苷類似物治療后HBV多聚酶(P區)基因變異的主要類型、發生頻率、與初始使用核苷(酸)類藥物種類、耐藥后加藥或換藥方案的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年8月—2016年2月在本院就診的慢性乙型肝炎患者，經核苷(酸)類似物經治6個月以上，且血清HBV DNA出現病毒學突破的108例患者，采用PCR產物直接測序法，分析HBV P區基因變異發生情況。其中69例檢測出基因型耐藥，39例未檢出基因型耐藥。對69例檢測出基因型耐藥病例進一步分析核苷(酸)類似物使用情況，發生耐藥基因構成，耐藥位點數與使用藥物、血清HBV DNA關系。入組69例病例中，男53例，女16例，年齡24～88歲，平均年齡47.7±12.0歲。診斷及抗病毒治療指證符合《2010年中國慢性乙型肝炎防治指南》，無核苷(酸)類似物應用禁忌證。

1.2 方法

所有病例按服藥不同分組: ① 單藥治療組：單用拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、替比夫定(LDT)、恩替卡韋(ETV)。② 序貫治療組：按使用藥物時間順序分組。③ 按突變位點數分為單個位點突變組、2個位點突變組、3個及以上位點突變組。

1.3 檢測方法

① HBV DNA采用美國MX3000P核酸擴增實時熒光PCR檢測系統，試劑由上海復星長征醫學科學有限公司提供，結果以<500 copies/mL為陰性。② 血清HBV RT區擴增及測序：采用美國生物應用公司ABI3500XL基因測序儀及ABI原裝試劑進行擴增及測序。序列的生物信息學分析：采用Chromas 2和 Sequence Scanner v1.0軟件進行RT區序列分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件包進行操作。計量資料采用均數±標準差表示，各組間計量資料采用單因素方差分析，計數資料采用卡方檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

耐藥突變類型，突變位點共計12個, 24個類型; 其中rtM204I突變最多見(30.4%), 其次為rtL180M/rtM204I聯合突變(13.0%)。按突變位點數分類: ① 單個位點突變33例，具體為: rtM204I 突變21例, 13例為單用LAM, 1例為LAM聯合ADV, 6例為單用LDT, 1例為單用ETV; rtM204V突變1例，為單用LAM; rtM204V/I突變1例，為LAM聯合ADV; rtA181T突變4例, 2例為單用ADV, 1例為LAM/ADV二藥序貫, 1例為LAM/LDT/ETV三藥序貫; rtA181V突變3例, 2例為單用ADV, 1例為LAM/ADV二藥序貫; rtA181V/T突變1例，為LAM/ADV二藥序貫; rtN236T突變2例，為單用ADV。② 2個位點突變29例，具體為: rtL180M/rtM204I突變9例, 6例為單用拉米夫定, 3例為單用替比夫定; rtL180M/rtM204V突變4例, rtL180M/rtM204V/I突變3例, 6例為單用LAM, 1例為ADV/LAM二藥序貫; rtA181T/rtM204I、rtA181T/rtM204V突變各1例，分別為單用LDT、ADV各1例; rtA181T/rtN236T突變4例，其中1例為單用ADV, 3例為LAM/ADV二藥序貫; rtA181V/rtN236T突變2例, rtA181V/T/rtN236T突變1例, rtA181S/rtN236T突變1例，均為單用ADV; rtT184I/rtM204I突變2例，為單用LAM; rtV173L/rtM204I突變1例，為LAM/ETV二藥序貫。③ 3個位點及以上突變7例，分別為: rtV173L/rtL180M/rtM204I 突變1例, rtV173L/rtL180M/rtM204I/V突變2例, rtL180M/rtT184L/rtM204V突變2例, rtL180M/rtM204V/rtA181C突變1例, rtV173L/rtL180M/rtT184L/rtM204V突變1例。7例中1例為單用LAM, 1例為單用ETV, 其余5例為LAM、ADV、ETV不規則聯合或序貫使用。

3組變異患者發生變異后HBV DNA定量比較，單位點變異組、2個位點變異組、3個及以上位點變異組患者變異后HBV DNA定量分別為(5.996±1.855) log10 copies/mL、(6.619±1.234) log10 copies/mL、(6.844±1.809) log10 copies/mL。單位點變異組與2個位點變異組比較(t=-1.535、P=0.130), 單位點變異組與3個及以上位點變異組比較(t=-1.103、P=0.277), 2個位點變異組、3個及以上位點變異組比較(t=-0.395、P=0.695)，差異均無統計學意義。

3組變異患者發生變異前治療方法與變異位點數關系比較，分為單位點變異組與2個位點變異組、3個及以上位點變異組，2個位點變異組與3個及以上位點變異組患者分別比較，結果見表1。單位點變異組與2個位點變異組比較，差異無統計學意義(χ2=0.009，P>0.05), 單位點變異組與3個及以上位點變異組比較有顯著差異(χ2=8.21,P<0.01), 2個位點變異組與3個及以上位點變異組比較有顯著差異(χ2=8.25,P<0.01)。主要核苷類似物使用產生耐藥所占比例最高為拉米夫定(62.3%), 其次為阿德福韋(21.7%)及替比夫定 (15.9%), 恩替卡韋僅1例(1.4%)。39例未檢出基因型耐藥患者經詳細詢問病史，均為自行停藥導致HBV DNA升高。

表1 變異前治療方法與變異位點數關系比較

3 討 論

目前用于治療慢性乙型肝炎的NAs主要有5種：拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、替比夫定(LDT)、恩替卡韋(ETV)和替諾福韋酯(TDF)等。在長期的治療中可能會引起乙肝病毒耐藥。加之一些慢性乙型肝炎(CHB)患者在治療前體內已存在HBV 耐藥突變毒株，即預存耐藥[3-4]，是引起原發性無應答或早期應答不佳的原因之一。近年來已有不少關于預存耐藥的文獻報道，Xu等[3]對201例未接受NAs藥物的急性乙型肝炎者預存耐藥檢查，結果顯示7%的患者存在HBV預存耐藥變異。蓋洪鵬等[5]研究發現, CHB患者的預存耐藥總檢出率為17.19%, 其中LAM、ADV相關的預存耐藥率分別為7.81%、7.81%, 與ETV相關的耐藥率為1.56%。與未發生耐藥的患者相比，耐藥不僅可導致疾病進一步進展，并可增加發生肝功能失代償和肝細胞癌(HCC)的風險，還會加大后續治療的難度，增加長期治療的醫療成本。

本研究選取的符合入組條件的108例中69例檢出不同位點變異，檢出率為63.9%, 檢出的耐藥突變可以明確與藥物使用有關。耐藥發生率最高為拉米夫定(62.3%), 其次為阿德福韋(21.7%)及替比夫定 (15.9%), 恩替卡韋僅1例(1.4%), 說明低耐藥基因屏障藥物更易出現基因突變。恩替卡韋耐藥多由拉米夫定治療后出現病毒學突破序貫應用引起，恩替卡韋的初始治療才能體現其高耐藥基因屏障的優勢[6]。單位點變異與2個位點變異、3個及以上位點變異患者，在出現HBV基因型耐藥后, HBV DNA升高水平與P區基因突變位點數無相關性。3組變異患者發生變異前治療方法與變異位點數關系比較，單位點變異組與2個位點變異組無顯著差異(χ2=0.009,P>0.05), 單位點變異組與3個及以上位點變異組有顯著差異(χ2=8.21，P<0.01), 2個位點變異組與3個及以上位點變異組有顯著差異(χ2=8.25,P<0.01)。說明慢性乙型肝炎患者在口服NAs抗病毒治療中，出現HBV基因型耐藥后，發生3個及以上位點變異與NAs序貫及不規則聯合使用有相關性。本研究結果與薛彩花等[7]研究報道的初始用藥選擇不當、長期使用NAs、耐藥后的序貫治療等都是造成多重耐藥的原因相一致。相關研究[8]表明，治療過程中，不同的變異會先后出現，而且新的變異有可能代替先前的變異，聯合變異，如rt173, rt180等可使病毒的復制能力明顯上升，因此檢測HBV P區基因變異發生率對于抗病毒療效具有十分重要的意義。

[1] Zoulim F, Locamini S. Hepatitis viruss resistance to nucleos(t)ide analogues[J]. Gastroenterology, 2009, 137: 1593-1608.

[2] 參加乙型肝炎耐藥討論會專家. 核苷和核苷酸類藥物治療慢性乙型肝炎的耐藥及其管理[J]. 臨床肝膽病雜志, 2013, 29: 10-15.

[3] Xu Z, Liu Y, Xu T, et al. Acute hepatitis B infection associatd with durg-resistant hepatitis B virus[J]. J Clin Virol, 2010, 48: 270-274.

[4] Fung SK, Mazzuli T, Sherman M, et al. Pre-existing antiviral resisitance mutations among treatmen-naive HBV patients can be detected by a sensitive line probe assay[J]. J Hepatol, 2008, 48(Suppl2): s256.

[5] 蓋洪鵬, 孫偉翔, 袁德勝, 等. 預存耐藥對核苷(酸)類似物抗病毒治療應答和耐藥的影響[J]. 臨床肝膽病雜志, 2012, 28: 841-844.

[6] 郭曉鳳, 張超賢, 劉雁, 等. 恩替卡韋治療后乙型肝炎病毒多聚酶區耐藥基因檢測分析[J]. 中國醫學科學院學報, 2013, 35(4): 444-446.

[7] 薛彩花, 吳瑋, 安俊麗, 等. 987例乙型肝炎患者HBV-DNA P區多位點耐藥突變分析及臨床意義[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2014, 23: 1187-1190.

[8] 尹波, 安萍, 曹艷雪, 等. P基因區耐藥檢測在核苷類藥物治療乙型肝炎中的價值[J]. 中華肝臟病雜志, 2008, 13(2): 134-136.

Analysis in risk factors and gene mutation model of HBV polymerase region in patients with chronic hepatitis B after nucleoside analogues therapy

FAN Zhengqin, CAO Lingzhi, ZHAO Yun, QUAN Wen, SUN Zhengsong

(TheThirdPeople′sHospitalofYangzhou,NewAreaBranchofSubeiPeople′sHospital,Yangzhou,Jiangsu, 225125)

Objective To explore the variation in the gene mutation patterns and risk factors of HBV polymerase region (P) in chronic viral hepatitis (CHB) patients with nucleoside analogues therapy. Methods A total of 108 chronic hepatitis B patients with viral breakthrough after the treatment of nucleoside analogues were selected as the study subjects. The PCR product direct sequencing method was used to analyze the genetic variation of HBV P region. Results Among 108 cases, 69 cases were detected by gene drug resistance, and the mutation type amount to 12, among which rtM204I was the most common (30.4%), and the second was rtL180M/rtM204I combined mutation (13%). The proportion of the major nucleoside analogues resistance highest proportion of lamivudine was 62.3%, followed by adefovir dipivoxil (21.7%) and telbivudine (15.9%). There were 33 cases with a single site mutation, 29 cases with two sites mutation and 7 cases with three and above sites mutation. In the 7 cases, 1 case was treated with lamivudine, 1 case with entecavir, and the remaining 5 cases with irregular combined or sequential use of lamivudine, adefovir dipivoxil and entecavir. Conclusion The amino acid of HBV P gene resistant mutation is complex and varied, and rtM204V/I mutation is the most common type. Three and above sites mutation is associated with irregular combined or sequential use of lamivudine, adefovir dipivoxil and entecavir.

hepatitis B; nucleoside analogues; drug resistance; mutation

2016-09-25

江蘇省揚州市2015市重點研發計劃-社會發展(YZ2015066)

R 512.6

A

1672-2353(2017)05-054-03

10.7619/jcmp.201705015