吳門調(diào)脂顆粒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的干預(yù)研究

吳瑛瀅, 張國(guó)興, 柳 笛, 田莉莉, 周冠華,廖文琦, 戴 斌, 陳競(jìng)緯

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué), 江蘇 南京, 210000; 2. 蘇州大學(xué), 江蘇 蘇州, 215000;3. 蘇州市中醫(yī)醫(yī)院, 江蘇 蘇州, 215000)

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吳門調(diào)脂顆粒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的干預(yù)研究

吳瑛瀅1, 張國(guó)興2, 柳 笛2, 田莉莉2, 周冠華1,廖文琦1, 戴 斌1, 陳競(jìng)緯3

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué), 江蘇 南京, 210000; 2. 蘇州大學(xué), 江蘇 蘇州, 215000;3. 蘇州市中醫(yī)醫(yī)院, 江蘇 蘇州, 215000)

目的 研究調(diào)脂顆粒對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)在細(xì)胞、蛋白質(zhì)、分子水平自噬的影響。方法 運(yùn)用血清藥理學(xué)方法，以調(diào)脂顆粒含藥血清、6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA)、雷帕霉素(Rapamycin)誘導(dǎo)處理HUVECs, 通過MTT比色法檢測(cè)調(diào)脂顆粒含藥血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響, Western blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的相對(duì)表達(dá)量變化，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)目變化。結(jié)果 調(diào)脂顆粒含藥血清處理HUVECs后，細(xì)胞活力無明顯改變，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的相對(duì)表達(dá)上調(diào)，自噬小體數(shù)量顯著增加(P<0.05)。調(diào)脂顆粒含藥血清聯(lián)合雷帕霉素處理HUVECs后，細(xì)胞活力無明顯改變，較雷帕霉素單獨(dú)處理自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的相對(duì)表達(dá)顯著下降，自噬小體數(shù)量顯著減少(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 調(diào)脂顆粒能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的過度自噬，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞適度自噬。

自噬; 中醫(yī)藥; 內(nèi)皮細(xì)胞; 心血管疾病

調(diào)脂顆粒是由蘇州中醫(yī)醫(yī)院已故汪達(dá)成主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，在吳門醫(yī)派的學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)下所創(chuàng)制，由蒲黃、澤瀉、姜黃等組成。既往研究[1]表明調(diào)脂顆粒可能通過上調(diào)肝組織中PPARγ及LFABP蛋白的表達(dá)，加速對(duì)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝抑制小鼠高脂血癥的形成。調(diào)脂顆粒也可能通過上調(diào)hSR-BⅠ/CLA-1的表達(dá)，達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[2]。大量研究[3-5]表明，動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生與內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙密不可分。自噬通過參與各個(gè)通道蛋白的表達(dá)，得以維持細(xì)胞內(nèi)分解代謝的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)控細(xì)胞質(zhì)成分和細(xì)胞器成分，對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生一定影響[6-10]。本研究探討調(diào)脂顆粒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的自噬的影響，分析調(diào)脂顆粒抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)由蘇州大學(xué)血液所老師惠贈(zèng); 調(diào)脂顆粒購(gòu)自蘇州市中醫(yī)醫(yī)院(批號(hào): 150915); 3-MA購(gòu)自Sigma公司(批號(hào): 124m4071v); Rapamycin購(gòu)自LC Laboratories(批號(hào): ASW-122); 胎牛血清購(gòu)自普飛生物公司(批號(hào): 1A2375); DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco(批號(hào)31715008); 胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(批號(hào): C0201); DMSO購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(批號(hào): s7038); MTT試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(批號(hào)C0009); 明膠購(gòu)自Sigma公司(批號(hào): G8060); LC3B抗體(Western blot)購(gòu)自Sigma公司, 095m4815v; LC3B抗體(免疫熒光)購(gòu)自Abcam公司(批號(hào): L7543); 裂解液(中)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(批號(hào): P0013C)。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和分組：內(nèi)皮細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 2～3 d換液1次，待細(xì)胞融合至80%～90%, 以胰酶消化液消化傳代。傳至2～3代后用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為生理、病理組，其中生理組包括空白對(duì)照組、調(diào)脂顆粒高中低組(濃度為9%、3%、1%)、3-MA( 2 mmol/L)陰性對(duì)照組，病理組包括空白對(duì)照組、雷帕霉素+調(diào)脂顆粒高、中、低含藥血清組、雷帕霉素+3-MA陰性對(duì)照組、雷帕霉素(10 mg/L)陽(yáng)性對(duì)照組。細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后加入各藥物處理48 h。

1.2.2 調(diào)脂顆粒含藥血清的制備: SD大鼠, 6周齡，雌雄各25只，體質(zhì)量為(200±10) g, 由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, SPF(specified-pathogens free)級(jí)，經(jīng)蘇州大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。隨機(jī)分為2大組，調(diào)脂顆粒組20只和空白對(duì)照組30只。調(diào)脂顆粒組按照臨床等效劑量組的3倍濃度，臨床等效劑量=臨床用量(2 g, 2次/d)×等效劑量系數(shù)(按體表面積折算)，按人-大鼠體表面積比值折算大鼠的等效劑量，人(70 kg)與大白鼠(200 g)的體表面積折算的系數(shù)為0.018, 即大鼠/kg體質(zhì)量用藥(高劑量)=人(70 kg)用藥×0.018/0.2×3, 即以0.06 g/kg濃度劑量灌胃給藥，空白對(duì)照組以等量蒸餾水灌胃, 2次/d, 連續(xù)灌胃3 d。第4天(在末次給藥前禁食12 h)給藥1 h后乙醚麻醉, 75%酒精浸泡消毒，于超凈工作臺(tái)上打開腹腔，暴露其腹主動(dòng)脈，取血, 4℃靜置30 min分層，離心(4℃, 3 000 r/min, 15 min)，抽取血清，同種條件血清混勻，置56 ℃水浴30 min滅活，分裝后置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MTT測(cè)定細(xì)胞活性：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞傳代接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后分別加入濃度為9%、3%、1%調(diào)脂顆粒含藥血清、3-MA( 2 mmol/L)、雷帕霉素(10 mg/L), 每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h, 加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL, 37 ℃孵育4 h后吸去上清，每孔加入100 μL Formazan溶解液溶解結(jié)晶，繼續(xù)37 ℃孵育4 h后用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)吸光度值。

1.3 Western blot檢測(cè)LC3-Ⅱ的表達(dá)。

1.3.1 蛋白的提取：將內(nèi)皮細(xì)胞以各藥物相應(yīng)處理48 h后，以含抑制劑的裂解液(每990 μL裂解液加10 μL PMSF)裂解10 min, 超聲儀超聲粉碎細(xì)胞, 4℃ 12 000 r/min離心10 min, 取上清, BCA法測(cè)定蛋白濃度，并定量，加loading buffer煮沸5 min, 封裝保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 Western blot: 首先配置12%的下層膠和5%的上層膠，每孔加樣15 μL, 電泳設(shè)置濃縮膠70 V, 30 min; 分離膠110 V, 60～90 min, 然后切下相應(yīng)分子量膠條，恒定電流, 300 mA, 60 min。5%脫脂牛奶封閉孵育1.5 h, 加入配制好的一抗, 4 ℃孵育過夜。加入配置好的二抗，孵育1～1.5 h。于凝膠成像儀下顯影，計(jì)算灰度值。

1.3.3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)目變化：將細(xì)胞接種于含0.1%明膠的24 孔板, 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 按各分組加入藥物處理48 h。以1∶1丙酮：甲醇配制而成的固定液固定15 min, 以0.2% TritonX-100, 室溫避光孵育10 min, 以1%BSA封閉60 min, 以一抗(稀釋為1∶1 000)4 ℃過夜，以二抗(稀釋為1∶1 000)室溫避光孵育60 min, DAPI室溫避光孵育10 min, 依次用50%、75%、95%、100% 的乙醇脫水。封片液封片，指甲油固定玻片四周，于激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬小體的數(shù)目變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 調(diào)脂顆粒、3-MA及雷帕霉素處理48 h對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生存率(活力)的影響

將96孔板中生長(zhǎng)面積為70%～80%的內(nèi)皮細(xì)胞用調(diào)脂顆粒含藥血清(濃度為9%、3%、1%)、3-MA抑制劑(2 mmol/L)、雷帕霉素(10 mg/L)及雷帕霉素聯(lián)合調(diào)脂顆粒處理48 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，測(cè)定吸光度(吸光度和細(xì)胞生存活力成正相關(guān))。結(jié)果見表1、2和圖1、2，可見調(diào)脂顆粒、3-MA、雷帕霉素及雷帕霉素聯(lián)合調(diào)脂顆粒作用48 h后與對(duì)照組相比，吸光度與空白組無差異，說明細(xì)胞生存沒有受到影響，表明各組藥物處理48 h后沒有造成細(xì)胞死亡。

表1 生理組處理48 h對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生存率的影響

表2 病理組處理48 h對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生存率的影響

2.2 調(diào)脂顆粒、3-MA及雷帕霉素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響

對(duì)六孔板中血管內(nèi)皮細(xì)胞分別用調(diào)脂顆粒含藥血清(濃度為9%、3%、1%)、3-MA抑制劑(2 mmol/L)、雷帕霉素(10 mg/L)及雷帕霉素聯(lián)合調(diào)脂顆粒處理48 h后, Western blot檢測(cè)LC-3 Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)量的變化。結(jié)果見圖3、4, 可見生理組中，隨著含藥血清濃度的降低，細(xì)胞自噬增加，高、中濃度組存在顯著差異(P<0.05), 提示高、中濃度含藥血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的有促進(jìn)作用。病理組中，雷帕霉素明顯誘導(dǎo)自噬，其與調(diào)脂顆粒共同處理的組別中，細(xì)胞自噬降低，低濃度組與雷帕霉素組相比，存在顯著差異(P<0.05), 高濃度組及中濃度組與雷帕霉素相比，存在顯著差異(P<0.01)。雷帕霉素聯(lián)合3-MA組作為陰性對(duì)照，與調(diào)脂顆粒組無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 生理組處理48h對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生存率的影響(n=4)

圖2 病理組處理48h對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生存率的影響(n=4)

2.3 自噬小體免疫熒光結(jié)果

高中低濃度調(diào)脂顆粒含藥血清、3-MA、雷帕霉素及雷帕霉素聯(lián)合調(diào)脂顆粒含藥血清處理血管內(nèi)皮細(xì)胞48 h 后，免疫熒光標(biāo)記LC3B蛋白，圖中胞質(zhì)內(nèi)綠色小點(diǎn)即是自噬小體。計(jì)算不同組別的細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)目，結(jié)果見圖5、6。生理組中，空白對(duì)照組未見明顯自噬小體，調(diào)脂顆粒含藥血清組較空白組自噬小體數(shù)量顯著增多(P<0.01)。病理組中，雷帕霉素組自噬小體數(shù)量較空白組顯著增多(P<0.01), 調(diào)脂顆粒含藥血清與雷帕霉素共同處理組自噬小體數(shù)量比雷帕霉素組顯著減少(P<0.01), 說明調(diào)脂顆粒含藥血清對(duì)生理狀態(tài)下的細(xì)胞有促進(jìn)自噬作用，病理狀態(tài)下的內(nèi)皮細(xì)胞的自噬具有抑制作用。

與control比較,*P<0.05圖3 生理組對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響(n=6)

與R比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 病理組對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響(n=6)

與control比較,**P<0.01圖5 生理組自噬小體的數(shù)目變化(n=3)

與R比較,**P<0.01圖6 病理組自噬小體的數(shù)目變化(n=3)

3 討 論

隨著物質(zhì)水平的提高，人們飲食習(xí)慣的改變，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重危害人類健康，對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化的研究日益重要。雖然動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但大量研究[11]表明內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生存在相關(guān)性。另有研究[12]顯示，細(xì)胞適度自噬可增加斑塊穩(wěn)定性，反之過度自噬則加快動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。

曹雪明等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃連素通過上調(diào)H9C2心肌細(xì)胞自噬水平，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。楊亭等[14]研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸青藤堿通過ERK通路誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生自噬，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣作用。張啟梅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，沙棘黃酮可明顯上調(diào)粥樣硬化大鼠細(xì)胞自噬水平，從而產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。較多研究[16-20]都觀察了上調(diào)自噬對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響，而未涉及抑制自噬對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響。本研究成功運(yùn)用雷帕霉素使細(xì)胞自噬各項(xiàng)指標(biāo)明顯升高，使細(xì)胞處于過度自噬狀態(tài)，成功運(yùn)用3-MA抑制劑，使過度自噬狀態(tài)的細(xì)胞自噬指標(biāo)下降，抑制細(xì)胞過度自噬。此次試驗(yàn)中調(diào)脂顆粒含藥血清中濃度組為人臨床用藥量折合人與大鼠體表面積量，其調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的效應(yīng)優(yōu)于高、低濃度組，驗(yàn)證了臨床用藥劑量的合理性。

調(diào)脂顆粒含藥血清在細(xì)胞生理狀態(tài)下使各項(xiàng)自噬指標(biāo)升高，促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的自噬，但不影響細(xì)胞活力說明調(diào)脂顆粒促進(jìn)細(xì)胞適度自噬[21-25]。雷帕霉素聯(lián)合調(diào)脂顆粒含藥血清處理內(nèi)皮細(xì)胞后, LC3- Ⅱ蛋白表達(dá)量下降，免疫熒光自噬小體數(shù)量減少，各項(xiàng)自噬指標(biāo)與3-MA無明顯差異，說明調(diào)脂顆粒可抑制內(nèi)皮細(xì)胞過度自噬，其抑制內(nèi)皮細(xì)胞自噬的效應(yīng)與3-MA相似[26-30]。

綜上所述，調(diào)脂顆粒具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞過度自噬，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞適度自噬的作用，可能是其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。

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Intervention of tiaozhi granules on autophagy of HUVECs

WU Yingying1, ZHANG Guoxing2, LIU Di2, TIAN Lili2,ZHOU Guanhua1, LIAO Wenqi1, DAI Bin1, CHEN Jingwei3

(1. Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing, Jiangsu, 210000;2. Soochow University, Suzhou, Jiangsu, 215000; 3. Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Suzhou, Jiangsu, 215000)

Objective To investigate the effect of tiaozhi granules on the autophagy of HUVECs in the cell, protein and molecular levels. Methods HUVECs were induced by tiaozhi granule medicated serum, 6-amino-3-methyl purine (3-MA) and rapamycin. MTT was used to detect the cell viability after 48 hours with tiaozhi granule medicated serum. Western blot was used to detect the expressive level of LC3-Ⅱ. Immunofluorescence was used to detect change in the numbers of autophagosomes. Results After HUVECs was processed by tiaozhi granule medicated serum, the cell viability had not change, the relative expression of autophagy related protein LC3-Ⅱ increased, and the number of autophagosomes increased (P<0.05). After HUVECs was processed by tiaozhi granule medicated serum and rapamycin, cell viability had no change, while the relative expression of autophagy related protein LC3-Ⅱ and the number of autophagosomes decreased significantly when compared with the results of intervention with rapamycin only (P<0.05 orP<0.01). Conclusion Tiaozhi granules can inhibit excessive autophagy of endothelial cells and promote moderate autophagy in endothelial cells.

autophagy; traditional Chinese medicine; endothelial cells; cardiovascular disease

2016-11-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(81470563); 江蘇省蘇州市科技局研究基金(sys201364; sys201573)

陳競(jìng)緯

R 329.2

A

1672-2353(2017)05-049-05

10.7619/jcmp.201705014