Claudin-4在炎癥性腸病小鼠結腸黏膜中的表達及意義

衡廣蓉, 丁巖冰, 路國濤

(揚州大學附屬醫院 消化科, 江蘇 揚州, 225001)

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Claudin-4在炎癥性腸病小鼠結腸黏膜中的表達及意義

衡廣蓉, 丁巖冰, 路國濤

(揚州大學附屬醫院 消化科, 江蘇 揚州, 225001)

目的 觀察claudin-4在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠炎癥性腸病(IBD)模型中的表達，探討claudin-4在IBD發病機制中的作用。方法 對14只C57BL/6小鼠采用2.5%DSS持續經飲水途徑飼養7 d建立IBD模型，另取6只作對照，自由飲水，于第8天觀察結腸組織病理學變化，應用免疫組織化學染色，免疫印跡檢測結腸黏膜中claudin-4的表達。結果 模型組體質量變化、病理學改變證實造模成功。與對照組比較，模型組小鼠的claudin-4表達顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 Claudin-4在IBD小鼠結腸黏膜中表達下降，可能在IBD發病中起到重要作用。

claudin-4; 葡聚糖硫酸鈉; 炎癥性腸病

腸黏膜屏障是腸道的重要防御屏障，它可以有效阻止抗原的入侵。腸黏膜屏障功能異常被認為是IBD發病的分子基礎。受損的腸黏膜屏障使得腸腔內抗原物質向腸黏膜固有層移位，激活固有層免疫細胞，導致異常的免疫反應發生。而緊密連接的中斷可能是腸黏膜屏障損傷的關鍵因素。為進一步了解緊密連接蛋白在炎癥性腸病發病中所起的作用，本實驗采用2.5%DSS飼養小鼠建立IBD模型，研究緊密連接蛋白claudin-4在IBD中的表達變化，以便為進一步研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

20只健康、清潔的C57BL/6雌性小鼠購自揚州大學動物實驗中心，體質量17～23 g。DSS, MW: 36 000-50 000, 購自MP Biomedicals; 兔抗羊claudin-4購自SANTA公司; PV9003超敏二步法免疫組化檢測試劑盒、濃縮型DAB試劑盒購自中杉金橋生物技術公司; 兔抗羊IgG HRP標記二抗購自Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 炎癥性腸病模型的建立: 20只小鼠適應環境1周, 14只為模型組, 6只為對照組。模型組以2.5%DSS持續經飲水途徑飼養7 d, 對照組自由飲水。

1.2.2 實驗步驟：第8天處死小鼠，留取距肛門4 cm處2 cm結腸，4%多聚甲醛浸泡24 h, 常規石蠟包埋，1份留作病理學切片，蘇木素-伊紅(HE)染色; 另一份用于腸道標本用于免疫組織化學染色。留取距肛門2 cm結腸標本1 cm, -80 ℃冰箱保存，用于免疫印跡。小鼠飼養、造模、手術取材過程均在揚州市第一人民醫院中心實驗室完成。1.2.3 小鼠模型的評價: ① 癥狀、體征：記錄小鼠每天體質量、毛色、活力、進食及大便情況。綜合評價小鼠的生長狀態。② 腸道組織病理學檢查：取蠟塊, 5 μm厚連續切片, HE染色，光鏡下觀察。

1.2.4 免疫組織化學染色：石蠟標本行5 μm連續切片，常規脫蠟，水洗，室溫下3%過氧化氫孵育10 min去除內源性過氧化氫酶，高壓抗原修復, 5%BSA封閉10 min, 滴加claudin-4抗體(1∶250)后4 ℃過夜，同時以PBS代替一抗做空白對照，次日滴加聚合物輔助劑15 min, 滴加辣根酶標記抗山羊IgG聚合物15 min, DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，鏡檢。

1.2.5 免疫印跡：取總蛋白50 μg上樣進行SDS-PAGE電泳，通過電轉移法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉移至PVDF膜上, 5%BSA封閉，一抗(兔抗羊claudin-4: 1∶750; β-actin: 1∶2500)4 ℃孵育過夜, TBST洗滌10 min, 3次，二抗室溫孵育1 h, TBST洗滌10 min, 3次, ECL顯影。

1.3 統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差表示。2組比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 IBD模型小鼠的一般情況及結腸組織學變化

IBD模型小鼠在第3天開始出現腹瀉，后相繼出現黏液血便，皮毛無光澤，活力下降，飲食、飲水減少，體質量下降。第8天, IBD模型小鼠體質量顯著下降，對照組小鼠體質量略有上升(圖2)。模型組小鼠結腸變細，縮短(圖1)。HE染色觀察對照組小鼠結腸上皮各層結構清晰, IBD模型小鼠腸道炎癥主要集中在遠端結腸，出現腸上皮糜爛、潰瘍，中性粒細胞浸潤，杯狀細胞減少甚至消失，隱窩紊亂(圖3)。

圖1 小鼠結腸變化圖

圖2 小鼠體質量變化圖

圖3 小鼠結腸HE染色圖 (A. 對照組 100倍; B. 模型組 100倍)

2.2 免疫組化檢測claudin-4 在IBD小鼠結腸黏膜的表達

claudin-4在對照組小鼠結腸組織靠近腸腔面上皮細胞的細胞膜中強表達，胞質中少許表達，模型組小鼠結腸中表達顯著減少，甚至缺失(圖4)。

A. 對照組 100倍; B. 模型組 100倍; C. 對照組 400倍; D. 模型組 400倍

圖4 小鼠結腸claudin-4免疫組化染色圖

2.3 Western blot 檢測claudin-4的表達

以β-actin為內參, Western blot 檢測第8天小鼠腸黏膜上皮claudin-4的表達水平，結果經Image J軟件定量分析，發現對照組claudin-4的表達量是模型組的2.94倍, IBD模型組claudin-4的表達量低于對照組, 差異有統計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖5 小鼠結腸claudin-4蛋白表達及相對表達量變化, *P<0.05 vs control組

3 討 論

炎癥性腸病是包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病在內的一組非特異性炎癥性疾病，具體發病機制尚不十分清楚，目前認為是由遺傳、環境和免疫等多種因素共同所致，臨床上主要表現為慢性腹瀉、黏液血便、腹痛、腸梗阻、穿孔等，具有不易治愈、反復發作的特點，嚴重影響患者的生活質量。

緊密連接是細胞間連接的一種，由緊密連接蛋白構成，在腸黏膜屏障中起關鍵作用[1], 主要包括occludin、claudin、連接黏附分子(JAMs)和閉合小環蛋白(ZO-1-、ZO-2、ZO-3 )等。緊密連接蛋白形成的復合體主要存在于上皮細胞、內皮細胞之間，使相鄰細胞膜緊密地連接在一起，具有封閉細胞間隙的作用。研究[2]發現, claudin是緊密連接的功能和結構的基礎，通過大小、電荷選擇性影響著細胞間的物質轉運，它的異常表達可致緊密連接的結構破壞，腸黏膜屏障功能受損，從而影響炎癥性腸病的發生發展。有學者[3]在動物實驗中發現，先天性基因敲除上皮細胞緊密連接蛋白的小鼠出生后出現了類似于炎癥性腸病的腸道病理變化，提示claudin參與了炎癥性腸病的發病。

Claudin-4 是claudin 家族的主要成員之一，對緊密連接的功能至關重要[4], 它編碼于人類染色體7q11.23, 共有209個氨基酸組成，主要分布在肺、腎、腸道組織和腦組織中。它有4個疏水的跨膜區, 2個長度不等的細胞外環形結構、1個細胞內環結構及位于細胞質中的氨基端和羧基端。較大的細胞外環上含帶電荷的氨基酸，決定著細胞間的跨上皮電阻和細胞外電荷的選擇，可以調控物質的通透性。羧基端具有潛在的磷酸化位點，磷酸化后可調節claudin 蛋白在緊密連接復合體中的定位，且C端184-319位氨基酸殘基是與產氣莢膜梭菌腸毒素(CPE )結合的位點。

Aono等[5]發現，突變claudin-4磷酸化位點的氨基酸后緊密連接的形成也受到了嚴重的干擾，這說明claudin- 4的調節對于緊密連接的功能至關重要。本實驗中發現, claudin-4在IBD中表達顯著降低，這與既往研究[6-7]相符，提示claudin-4的減少可能對IBD的發生起促進作用，它可能是通過破壞緊密連接復合體的結構引起腸道黏膜屏障功能受損，進而引起抗原移位、免疫損傷，促進腸道炎癥發生[8]。claudin-4在IBD發病中的具體機制尚不十分清楚。研究[9]發現，TNF-α、IFN-γ 可直接抑制claudin-4的表達，并能使Rho相關激酶(ROCK )和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)等緊密連接調節蛋白表達上調，促進緊密連接蛋白被細胞內吞而降解，使claudin-4表達下調。蛋白激酶C途徑可使claudin-4蛋白磷酸化，從而引起claudin-4表達下降，分布變化，使得緊密連接蛋白松散破壞[10]。claudin-4的異常表達可能與其啟動子區域的多態性有關。上皮生長因子可經激活MEK/ERK后進一步促進轉錄因子Sp1的表達，后者可結合到claudin-4的啟動子區域，引起claudin-4的表達變化[11]。轉錄因子snail可直接結合到啟動子區域抑制claudin-4的表達。在食管癌的研究[12]中發現，轉錄因子Twist 1可下調claudin-4 的表達。

Claudin-4是CPE的受體，兩者結合后可通過包膜穿透作用使細胞溶解壞死，應用這一特性, claudin-4目前在促進疫苗的吸收及腫瘤的局部治療方面表現出了廣闊前景。炎癥性腸病的病灶在腸黏膜上，可以考慮應用claudin-4促進藥物的吸收的特性進行局部治療以促進臨床病情的緩解。

Claudin-4在維持腸黏膜屏障中發揮著重要作用，與炎癥性腸病的發生密切相關。雖然目前對它及其調節機制認識尚不足，但從緊密連接角度去研究炎癥性腸病已成為研究的熱點之一。深入研究claudin-4的功能、調節機制和臨床應用有利于促進和維持炎癥性腸病患者的臨床病情緩解，減少激素及細胞毒藥物的使用，可以極大地提高患者的生活質量，具有重要的臨床意義。

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Expression and significance of claudin-4 in colon mucosa of mice with inflammatory bowel disease

HENG Guangrong, DING Yanbing, LU Guotao

(DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofYangzhouUniversity,Jiangsu225001)

Objective To observe the claudin-4 expression in inflammatory bowel disease mice models which induced by dextran sulfate sodium (DSS). Methods Fourteen mice were established inflammatory bowel disease models induced by 7-day administration of 2.5% DSS in water. The other six mice were fed with water only as control group. Pathological changes in colon mucosa were observed on the eighth day. Immunohistochemistry and western blot were used to measure the protein expression of claudin-4 in colon mucosa. Results IBD model was successfully established according to weight and pathological changes. The claudin-4 expression in the model group mice decreased significantly compared with control group and the difference was statistically significant(P<0.05). Conclusion Claudin-4 expression level decreased in colon mucosa of IBD mice. The change of the claudin-4 expression may play an important role in IBD development and progression.

claudin-4; Dextran sulfate sodium; inflammatory bowel disease

2016-11-21

江蘇省揚州市社會發展項目(YZ2011088)

丁巖冰

R 574

A

1672-2353(2017)05-011-04

10.7619/jcmp.201705003