NEP1-40對缺氧缺血性腦病新生大鼠的Wnt信號通路胞增殖的調控作用

王 驊, 王靜成, 王永祥, 王大新, 陶玉平,馮新民, 熊傳芝, 顧加祥, 何金山

(江蘇省蘇北人民醫院 骨科, 江蘇 揚州, 225000)

?

論 著

NEP1-40對缺氧缺血性腦病新生大鼠的Wnt信號通路胞增殖的調控作用

王 驊, 王靜成, 王永祥, 王大新, 陶玉平,馮新民, 熊傳芝, 顧加祥, 何金山

(江蘇省蘇北人民醫院 骨科, 江蘇 揚州, 225000)

目的 探討Nogo-A受體拮抗劑NEP1-40對Wnt信號通路和神經細胞增殖的調控作用。方法 40只大鼠被均分為HIBD(缺氧缺血性腦損傷)組和HIBD+NEP1-40組，采用PCR定量、Western blot分析、細胞增殖的免疫組化試驗、8-異前列腺素評估等檢測分析缺氧缺血性腦病新生大鼠的修復過程中Wnt信號通路中NgR的轉錄因子調控與神經細胞增殖。結果 NEP1-40處理后, cJun和c-Myc的表達在蛋白水平上調，基因表達水平上調, Ki-67增加, 8-異前列腺素無顯著變化。結論 通過抑制NgR后發現, c-Jun和c-Myc是Wnt通路的主要轉錄因子，同時腦室下區神經細胞的增殖增加。

缺氧缺血性腦病; Wnt信號通路; Nogo-A; NEP1-40; 神經細胞增殖

缺氧缺血性腦病(HIE)是由于各種圍生期因素引起的腦缺氧或缺血而形成的常見腦損傷。對于HIE新生兒來說，神經細胞再生是一個至關重要的受損腦組織修復過程[1]。抑制劑能降低中樞神經系統(CNS)的自我修復能力，其中Nogo A尤為重要[2]。Nogo A是已知的特定中樞神經系統神經突起生長的抑制劑，它屬于編碼網狀組織的基因家族，與內質網有關[3]。中樞神經系統損傷后, Nogo A抑制神經元軸突再生及其突觸的重塑[4], 也可能抑制高等脊椎動物中樞神經系統的再生[5]。Kmari等[6]應用RT-PCR對正常老化的小鼠腦組織Nogo A蛋白和mRNA水平進行分析，證實Nogo A蛋白水平在衰老過程中具有改變突觸可塑的作用。Nogo A基因敲除成年小鼠中樞神經系統軸突導向因子增加，在體內促進軸突的再生[7]。 Nogo-66受體(NgR)連同少突神經細胞-髓磷脂糖蛋白和髓鞘相關糖蛋白共同介導抑制軸突生長，調節成人中樞神經系統的軸突再生及可塑性[8-9]。Wnt信號通路調控著胚胎以及成人的細胞與細胞間聯系，包括在發育和修復期間的細胞增殖和分化[10]。研究[11]表明, Wnt信號通路參與了由Nogo介導的神經細胞再生，但其機制仍然未知。本實驗使用NgR的拮抗劑NEP1-40, 研究其對受損中樞神經的再生及相關轉錄因子(TF)的作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 構建動物模型和藥物治療

采用新生雄性Wistar大鼠40只(7 d齡，體質量為(16±3.0) g, 揚州大學的動物研究中心提供)。新生缺氧缺血性腦病大鼠動物模型按經典法構建，該法由Vannucci于1981年在Levine的成年大鼠缺氧缺血性腦損傷模型基礎上經過改進而建成，至今在全世界被廣泛應用。其具體操作方法如下：生后7 d大鼠麻醉后行左頸總動脈結扎術，術后恢復4～8 h后置于氧濃度為8%、環境溫度為37 ℃的密閉容器內持續缺氧3.5 h, 構建后被命名為缺氧缺血性腦損傷(HIBD)大鼠[12]。40只大鼠被分為HIBD組和HIBD + NEP1-40組，每組20只，NEP1-40處理7 d。

1.2 PCR定量

采用TRIzol(Invitrogen, 美國)分離大腦總RNA。采用PCR芯片(SABiosciences, 美國)用于檢測大鼠Wnt信號通路，其中包含APC、APC2、CCND1、CCND2、CCND3、CTNNB1、EP300、FGF4、FZD3、c-Jun、LRP5基因, c-Myc、Ppp2ca、PPP2R1A、WISP1、Wnt3a。采用cDNA合成裝備(Invitrogen, 美國)逆轉錄后，使用ABI Prism SDS 7000 (Applied Biosystems, 美國) 將所有的產物都用作實時PCR模板。步驟如下: ① 50 ℃ 2 min, 1循環; ② 95 ℃ 10 min, 1循環; ③ 95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s, 40循環; ④ 72 ℃ 10 min, 1循環。

1.3 Western blot分析

腦的總蛋白提取物(12 μg)加入4×緩沖液, 100 ℃煮5 min, 然后經10% SDS-PAGE凝膠(Invitrogen, 美國)。凝膠電泳后，轉移到NE膜(70 V, 2 h, 4 ℃)。5%脫脂牛奶封閉1 h后，膜用APC、EP300、c-Jun、c-Myc、Wnt3a的一抗(兔多克隆抗體IgG，Millipore)孵育, 3% BSA，根據實時PCR, 4℃ 過夜。1×TPBS洗滌后(pH 7.4), 膜與二抗(羊抗兔IgG)在室溫條件下孵育1 h, 1×TPBS再洗滌(pH 7.4), 拍攝照片(Kodak, 美國)用于分析。β-肌動蛋白作為陰性對照。

1.4 細胞增殖的免疫組化試驗

腦提取物通過免疫組化檢測Ki67的表達。制備了12 μm冰凍鼠腦冠狀切片(Leica), Ki67染色(Abcam、1∶1 000), 評估腦室下區神經干細胞的增殖。在激光共聚焦顯微鏡下拍攝的照片，背景為暗(Nikon, 100×)。

1.5 8-異前列腺素評估檢測

腦組織在加蛋白酶抑制劑(1∶1 000, Invitrogen, 美國)的TBS緩沖液中磨碎, 12 000 g/min 4 ℃離心40 min。上清液轉移至另一管?；钚匝鮎OS的特殊標記物8-異前列腺素水平，按照流程用試劑盒(Cayman Chemical Company, 美國)測定。

1.6 統計學分析

采用SPSS 13.0進行統計，所有數據以均數±標準差表示，結果用t檢驗進行評價。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NEP1-40對基因表達的影響

HIBD組APC、EP300、c-Jun、c-Myc、Wnt3a基因表達明顯增加(>1.35 fold), 而HIBD + NEP1-40組, CCND2、WISP1 用NEP1-40處理7 d后減少(<0.75 fold)。而其他基因無顯著變化(>1.5 fold或<0.75 fold)。HIBD組值設定為1, HIBD + NEP1-40組與HIBD組相比得出相對值。所有的數據分析見圖1。

2.2 NEP1-40對蛋白表達的影響

Western blot分析見圖 2, NEP1-40處理7 d后, cJun和c-Myc的表達在蛋白水平上調(>1.5 fold), 基因表達有相同的變化。然而APC、EP300、Wnt3a、CCND2、WISP1, 表達無明顯變化(>1.35 fold或<0.75 fold), 基因表達完全不同。HIBD組值設定為1, 而HIBD + NEP1-40組與HIBD組相比得相對值。見圖3。

a:>1.35fold;b:<0.75fold;*P<0.05;**P<0.01圖1 HIBD組與HIBD+NEP1-40組的基因表達對比分析

左:HIBD+NEP1-40組;右:HIBD組圖2 Westernblot分析結果

a:>1.35fold;*P<0.05;**P<0.01圖3 HIBD組與HIBD+NEP1-40組的蛋白表達對比分析

2.3 8-異前列腺素的檢測分析

8-異前列腺素是檢測組織器官中氧化應激的一個理想的生物標志物。HIBD + NEP1-40組和HIBD組之間無顯著的變化。本研究表明NEP1-40不能調節缺氧缺血性腦病中樞神經系統的氧化應激。HIBD組值設定為1, 而HIBD + NEP1-40組與HIBD組相比得相對值。見圖4。

圖4 HIBD組與HIBD+NEP1-40組的8-isoprostane檢測對比分析

2.4 神經細胞再生的分析

如圖5(Bar: 200 μm)箭頭所示Ki67, 在成人大腦中的神經細胞增殖的腦室下區, HIBD + NEP1-40組(圖5 A)與HIBD組(圖5 B)相比神經細胞的再生增加，或許有助于修復損傷的中樞神經系統。促進神經細胞的增殖對缺氧缺血性腦病患者的治療是一種潛在有效的方法。腦室下區Ki67的表達HIBD組值設定為1, 而HIBD + NEP1-40組與HIBD組相比得出相對值。見圖6。

A:HIBD+NEP1-40組;B:HIBD組圖5 HIBD組與HIBD+NEP1-40組的腦室下區Ki67表達檢測(200倍,Bar:200μm)

圖6 HIBD組與HIBD+NEP1-40組的腦室下區Ki67表達對比分析(*P<0.05)

3 討 論

許多蛋白質都參與了神經內分泌或神經內分泌細胞中的膜轉運, Nogo蛋白是其中之一[13]。Nogo-A具有2個已知的抑制作用域，包括氨基-Nogo(位于N-末端)和Nogo-66[5]。神經細胞損傷時阻斷 Nogo-A蛋白將有助于保護或修復受損的神經細胞。Nogo-66受體(NgR)對于Nogo蛋白的一個特定區域是一種高親和力結合受體，這個區域是一種抑制軸突生長的髓磷脂相關蛋白[14]。NgR關乎到神經細胞的可塑性和再生性[15]。Wnt信號通路在胚胎發育、細胞分化、細胞極性生成中發揮著多種重要作用[16], 尤其是轉移神經管腹側基因至背區[17]。在本研究中，發現c-Jun和c-Myc大多上調。c-Jun在整個月經周期對子宮內膜細胞的增殖和凋亡有重要作用[18]。c-Jun蛋白水平的周期性變化對腺上皮細胞增殖凋亡具有顯著意義[19]。c-Myc通過結合增強子Box序列和召集組蛋白乙酰轉移酶(HATs)激活大量的基因表達[20], 在各種有絲分裂信號包括 Wnt信號通路激活[21]。

8-異同前列腺素是一種理想的氧化應激標志物，其濃度變化可在不穩定的氧化應激中檢測到[22]。本研究表明, 2組間8-異同前列腺素無明顯變化。這一結果表明氧化應激與神經細胞損傷和神經細胞修復無關或未參與Nogo-A的抑制。Ki-67是細胞增殖標記物，與細胞增殖和細胞周期中各階段(G1, S, G2, 有絲分裂)密切相關，但與休眠細胞(G0)無關[23]。HIBD + NEP1-40組可檢測到Ki-67增加，意味著在大腦中的神經細胞增殖的地方腦室下區發生了神經細胞再生的增加。促進神經細胞增殖是一個潛在有效的方法治療HIE患者，有待進一步研究。

本研究主要集中在Nogo-A受體拮抗劑NEP1-40對調控Wnt信號通路與新生缺氧缺血性腦病大鼠神經細胞的增殖的影響，通過抑制NgR發現, c-Jun和c-Myc是Wnt通路的主要轉錄因子，而發生在腦室下區的神經細胞的增殖在此過程中增加。

[1] Pietrini D, Piastra M, Luca E, et al. Neuroprotection and hypothermia in infants and children[J]. Curr Drug Targets, 2012, 13(7): 925-935.

[2] Pernet V, Schwab M E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair[J]. Cell Tissue Res, 2012, 349(1): 97-104.

[3] Skaper S D. Neuronal growth-promoting and inhibitory cues in neuroprotection and neuroregeneration[J]. Methods Mol Biol, 2012, 846: 13-22.

[4] Zemmar A, Weinmann O, Kellner Y, et al. Neutralization of Nogo-A enhances synaptic plasticity in the rodent motor cortex and improves motor learning in vivo[J]. J Neurosci, 2014, 34(26): 8685-8698.

[5] Borrie S C, Baeumer B E, Bandtlow C E. The Nogo-66 receptor family in the intact and diseased CNS[J]. Cell Tissue Res, 2012, 349(1): 105-117.

[6] Kumari A, Thakur M K. Age-dependent decline of nogo-a protein in the mouse cerebrum[J]. Cell Mol Neurobiol, 2014, 34(8): 1131-1141.

[7] Kempf A, Montani L, Petrinovic M M, et al. Upregulation of axon guidance molecules in the adult central nervous system of Nogo-A knockout mice restricts neuronal growth and regeneration[J]. Eur J Neurosci, 2013, 38(11): 3567-3579.

[8] McDonald C L, Bandtlow C, Reindl M. Targeting the Nogo receptor complex in diseases of the central nervous system[J]. Curr Med Chem, 2011, 18(2): 234-244.

[9] Cao Z, Gao Y, Deng K, et al. Receptors for myelin inhibitors: Structures and therapeutic opportunities[J]. Mol Cell Neurosci, 2010, 43(1): 1-14.

[10] Budnik V, Salinas P C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity[J]. Curr Opin Neurobiol, 2011, 21(1): 151-159.

[11] Cerpa W, Toledo E M, Varela-Nallar L, et al. The role of Wnt signaling in neuroprotection[J]. Drug News Perspect, 2009, 22(10): 579-591.

[12] Cao Y, Shumsky J S, Sabol M A, et al. Nogo-66 receptor antagonist peptide (NEP1-40) administration promotes functional recovery and axonal growth after lateral funiculus injury in the adult rat[J]. Neurorehabil Neural Repair, 2008, 22(3): 262-278.

[13] Llorens F, Gil V, del Río JA. Emerging functions of myelin-associated proteins during development, neuronal plasticity, and neurodegeneration[J]. FASEB J, 2011, 25(2): 463-475.

[14] Teng F Y, Tang B L. Nogo-A and Nogo-66 receptor in amyotrophic lateral sclerosis[J]. J Cell Mol Med, 2008, 12(4): 1199-1204.

[15] Zhang S, Zhang Q, Zhang J H, et al. NgR acts as an inhibitor to axonal regeneration in adults[J]. Front Biosci, 2008, 13: 2030-2040.

[16] Cadigan K M. TCFs and Wnt/β-catenin signaling: more than one way to throw the switch[J]. Curr Top Dev Biol, 2012, 98: 1-34.

[17] Clevers H, Nusse R. Wnt/β-catenin signaling and disease[J]. Cell, 2012, 149(6): 1192-1205.

[18] Otsuki Y. Apoptosis in human endometrium: apoptotic detection methods and signaling[J]. Med Electron Microsc, 2001, 34(3): 166-173.

[19] Doucas H, Garcea G, Neal C P, et al. Changes in the Wnt signalling pathway in gastrointestinal cancers and their prognostic significance[J]. Eur J Cancer, 2005, 41(3): 365-379.

[20] Honeycutt K A, Roop D R. c-Myc and epidermal stem cell fate determination[J]. J Dermatol, 2004, 31(5): 368-375.

[21] Katoh M, Katoh M. WNT signaling pathway and stem cell signaling network[J]. Clin Cancer Res, 2007, 13(14): 4042-4045.

[22] Kim H S, Lee K, Kang K A, et al. Phloroglucinol exerts protective effects against oxidative stress-induced cell damage in SH-SY5Y cells[J]. J Pharmacol Sci, 2012, 119(2): 186-192.

[23] Lin T, Liu Y, Shi M, et al. Promotive effect of ginsenoside Rd on proliferation of neural stem cells in vivo and in vitro[J]. J Ethnopharmacol, 2012, 142(3): 754-761.

Role of NEP1-40 in regulation of Wnt signaling pathway and regeneration of neural cells in neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy

WANG Hua, WANG Jingcheng, WANG Yongxiang, WANG Daxin,TAO Yuping, FENG Xinmin, XIONG Chuanzhi, GU Jiaxiang, HE Jinshan

(DepartmentofOrthopedics,SubeiPeople′sHospital,Yangzhou,Jiangsu, 225000)

Objective To explore the role of Nogo-A receptor antagonist NEP1-40 in regulating regeneration of neural cells and related Wnt signaling pathway in neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy (HIBD). Methods A total of 40 HIBD rats were divided into HIBD group and HIBD+ NEP1-40 group, 20 rats in each group. PCR Test, Western Blot Analysis, IHC test for cell proliferation and 8-isoprostane detection were used to evaluate regulation of NgR transcription factors in Wnt signaling pathway and proliferation of neural cells. Results The expressions of c-Jun and c-Myc, at the protein level, were up-regulated after treatment with Nogo-A receptor antagonist NEP1-40 for 7 days, and the same change was observed at gene expression and Ki-67. There was no significant change of 8-isoprostane. Conclusion The c-Jun and c-Myc are the main transcription factors in Wnt signaling pathway by inhibition of NgR, and meanwhile the proliferation of nerve cells in subventricular zone increase.

hypoxic ischemic encephalopathy; Wnt signaling pathway; Nogo-A; NEP1-40; neural cell proliferation

2016-11-21

江蘇省揚州市社會發展科技攻關資助項目(YZ2011082); 江蘇省科技支撐計劃-社會發展資助項目(BE2013911);

江蘇省自然科學基金資助項目(BK20141281)

王永祥

R 742

A

1672-2353(2017)05-001-04

10.7619/jcmp.201705001