胃竇肌間Cajal間質(zhì)細(xì)胞自噬研究伴抑郁的FD發(fā)病機(jī)制

曾麗君 凌江紅 張麗敏 王煜姣 鄧 靜

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

胃竇肌間Cajal間質(zhì)細(xì)胞自噬研究伴抑郁的FD發(fā)病機(jī)制

曾麗君 凌江紅 張麗敏 王煜姣 鄧 靜

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

目的：分析基于胃竇肌間Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Myenteric Interstitial Cells of Cajal，ICC-MY）自噬研究伴抑郁的功能性消化不良（Functional Dyspepsia，F(xiàn)D）的發(fā)病機(jī)制。方法：20只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組，每組10只。模型組采用慢性?shī)A尾激惹刺激法制備FD大鼠模型。透射電鏡觀察兩組大鼠胃竇肌間Cajal間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量；免疫熒光法檢測(cè)兩組ICC-MY內(nèi)Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 B( microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B)蛋白的熒光強(qiáng)度。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠胃竇ICC-MY內(nèi)自噬體數(shù)量多，Beclin1、LC3B蛋白的熒光強(qiáng)度顯著升高（均P=0.000）。結(jié)論：伴抑郁的FD的發(fā)病機(jī)制可能與抑郁引起胃竇ICC-MY過(guò)度自噬有關(guān)。

功能性消化不良；抑郁；肌間Cajal間質(zhì)細(xì)胞；自噬

功能性消化不良（Functional Dyspepsia，F(xiàn)D）系指上腹不適癥狀如腹痛、腹脹、早飽、惡心等反復(fù)發(fā)作，且經(jīng)檢查排除器質(zhì)性、系統(tǒng)性、或代謝性疾病的一組癥侯群，胃動(dòng)力下降是其主要病理基礎(chǔ)之一。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D患者多伴有抑郁狀態(tài)[1,2]，其中尤以動(dòng)力障礙樣FD亞型抑郁情緒最多見(jiàn)[3]，此外54%抑郁癥患者均有消化道不適的主訴，部分患者甚至達(dá)到FD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，且研究已經(jīng)證實(shí)精神心理因素尤其是焦慮、抑郁是FD的促發(fā)因素[5]，但對(duì)于抑郁與FD的發(fā)病之間的具體關(guān)系尚不清楚。

肌間Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Myenteric Interstitial Cells of Cajal，ICC-MY）分布于胃腸道環(huán)形肌及縱行肌之間，產(chǎn)生慢波電位，是胃腸道的起搏細(xì)胞，調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動(dòng)，其中分布于胃竇的ICC-MY是胃電生理活動(dòng)的起搏細(xì)胞，對(duì)維持胃慢波起著廣泛性的決定作用。Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）的自噬或凋亡等引起胃腸道起搏電位、慢波節(jié)律等異常，是多種胃腸疾病發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制[6]。研究發(fā)現(xiàn)抑郁等不良情緒可激發(fā)細(xì)胞自噬[2]，而細(xì)胞過(guò)度自噬將導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7,8]。在此基礎(chǔ)上我們假說(shuō)FD胃動(dòng)力下降是否與抑郁引起胃起搏細(xì)胞ICC-MY過(guò)度自噬甚至細(xì)胞死亡有關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)將以ICCMY為觀察對(duì)象，觀察伴抑郁的FD大鼠胃竇ICC-MY內(nèi)自噬的情況。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康SPF級(jí)SD大鼠20只，雌雄各半，體重200g左右，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：scxk桂2009-0002。

1.2 主要試劑

c-kit山羊抗大鼠多克隆抗體（Santa Cruz，USA），Beclin1兔抗大鼠多克隆抗體（Thermo Fisher，USA），LC3B兔抗大鼠多克隆抗體（Thermo Fisher，USA），四甲基異硫氰酸羅丹明（Tetramethyl Isothiocyanate Rhodamine,TRITC）-驢抗山羊多克隆抗體（Santa Cruz，USA），異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate,FITC）-山羊抗兔多克隆抗體（Life，USA），4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)工作液（北京索萊寶公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與FD模型建立

將20只SD大鼠隨機(jī)分成2組：正常對(duì)照組、模型組，每組10只。模型組按張鈺琴等[12]采用慢性?shī)A尾激惹刺激法造模。模型組大鼠隨機(jī)每5只大鼠1籠，使用紗布包裹止血鉗，鉗夾鼠尾中后1/3，待大鼠出現(xiàn)尖叫、撕打等激惹表現(xiàn)后立即松開(kāi)止血鉗，30min／次?籠，2次／d，間隔12h，持續(xù)4周。

2.2 取材

圖1：ICC-MY特異性c-kit蛋白的表達(dá)（Nikon，×400）

末次給藥12h后用10%水合氯醛以0.3ml/100g的劑量腹腔注射麻醉大鼠，剖腹取胃，剪取距離幽門(mén)0.5cm處大小約3mm×3mm及5mm×10mm[13]的胃竇組織，立即用生理鹽水漂洗干凈，分別快速固定于5%戊二醛及4%多聚甲醛中留待后續(xù)檢測(cè)。

2.3 透射電子顯微鏡觀察胃竇ICC-MY內(nèi)自噬體的表達(dá)

固定于5%戊二醛的胃竇標(biāo)本經(jīng)前固定、漂洗、后固定、漂洗、塊染、脫水、浸漬后包埋成塊，65℃恒溫箱中36h，光鏡下半薄切片定位ICC-MY，確定位置后超薄切片機(jī)切片，透射電子顯微鏡觀察ICC-MY內(nèi)自噬體。

2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察兩胃竇ICC-MY內(nèi)C-kit、Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)

固定于4%多聚甲醛中的胃竇標(biāo)本經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋，切片機(jī)切片，65℃烤片3h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，清洗，抗原修復(fù)，清洗，0.1%硼氫化鈉室溫封閉，清洗，滴加山羊血清封閉，棄去山羊血清，分別滴加一抗（c-kit抗體濃度為1∶50； Beclin1、LC3B抗體濃度均為1∶100）4℃過(guò)夜；17h后37℃溫箱復(fù)溫30min，清洗，分別滴加二抗（TRITC、FITC多克隆抗體濃度為1∶100），37℃溫箱避光孵育90min，清洗，DAPI染核2min，充分清洗后滴加抗熒光衰減封片劑封片，以適于TRITC（550nm）、FITC（490nm）及DAPI（360nm）的激發(fā)波長(zhǎng)來(lái)觀測(cè)標(biāo)本，c-kit陽(yáng)性表達(dá)熒光為紅色，Beclin1、LC3陽(yáng)性表達(dá)熒光為綠色，DAPI染核為藍(lán)色。采用雙通道同步掃描，每一標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行Beclin1、LC3熒光強(qiáng)度分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 ICC-MY特異性c-kit蛋白的表達(dá)

見(jiàn)圖1。c-kit蛋白為ICC的特異性蛋白，分布于細(xì)胞膜表面，陽(yáng)性表達(dá)呈紅色。如圖所示，陽(yáng)性表達(dá)分布于胃竇肌層環(huán)形肌及縱行肌之間，代表ICC-MY的位置結(jié)構(gòu)。ICC-MY以團(tuán)狀結(jié)構(gòu)分布，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)少。

3.2 ICC-MY內(nèi)自噬體表達(dá)（見(jiàn)圖2）

正常對(duì)照組ICC-MY內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)明顯，偶見(jiàn)自噬體；模型組ICC-MY內(nèi)正常細(xì)胞器少見(jiàn)，可見(jiàn)大量自噬體。

3.3 ICC-MY內(nèi)Beclin1、LC3B蛋白熒光強(qiáng)度（見(jiàn)圖3、4，表1）

與正常對(duì)照組比較，模型組ICC-MY內(nèi)Beclin1、LC3B陽(yáng)性率高，熒光強(qiáng)度升高（均P=0.000）。

表1：兩組胃竇ICC-MY內(nèi)Beclin1、LC3B熒光強(qiáng)度的比較（±s）

表1：兩組胃竇ICC-MY內(nèi)Beclin1、LC3B熒光強(qiáng)度的比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，①P=0.000.

分組nBeclin1LC3B正常對(duì)照組1045.96±11.8836.78±11.37模型組1083.64±10.83①75.89±13.34①

圖2：胃竇ICC-MY內(nèi)自噬泡表達(dá)情況（日立H7650，×20000）

圖3 各組大鼠胃竇ICC-MY內(nèi)Beclin1表達(dá)（Nikon，×400）

圖4：各組大鼠胃竇ICC-MY內(nèi)LC3B表達(dá)（Nikon，×400）

4 討論

隨著對(duì)于FD發(fā)病機(jī)制研究的深入，精神心理因素在FD發(fā)病中越來(lái)越受到重視。臨床上使用心理治療或抗抑郁藥物治療伴抑郁的FD患者發(fā)現(xiàn)FD患者不僅抑郁狀態(tài)得到明顯改善，同時(shí)可以提高FD的臨床療效和生存質(zhì)量，胃排空改善，并且FD復(fù)發(fā)率明顯降低[9-12]。本課題組在前期研究[13]中模擬FD的發(fā)病機(jī)制采用慢性?shī)A尾激惹刺激法復(fù)制FD大鼠模型，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組大鼠比較模型組大鼠不僅出現(xiàn)了飲食量下降，體重增長(zhǎng)緩慢及胃動(dòng)力下降等消化不良表現(xiàn)，同時(shí)在抑郁測(cè)評(píng)如糖水消耗實(shí)驗(yàn)和敞箱實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出快感缺失、運(yùn)動(dòng)及探索行為能力明顯下降等抑郁表現(xiàn)，但對(duì)抑郁與FD發(fā)生的深層機(jī)制尚未進(jìn)行研究。

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞利用溶酶體對(duì)胞質(zhì)內(nèi)變性壞死的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器進(jìn)行降解的生物學(xué)過(guò)程[14]，其中涉及到多種蛋白的參與。Beclin1參與自噬前體的形成并引導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體上[15,16]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3( microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)蛋白首先會(huì)在合成后立即在其羧基端被Atg4所剪切，產(chǎn)生細(xì)胞漿定位的LC3-I。在自噬過(guò)程中，LC3-I會(huì)被包括Atg7和 Atg3在內(nèi)的泛素樣體系所修飾和加工，產(chǎn)生分子量為14 kD的LC3-II，并定位到自噬小體中，LC3B結(jié)合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量與細(xì)胞自噬的水平呈正比[17,18]。在正常細(xì)胞中，自噬維持在一個(gè)較低的水平以保持細(xì)胞的自穩(wěn)態(tài)，但嚴(yán)重或快速的細(xì)胞自噬將導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡。研究已經(jīng)證實(shí)抑郁可引起細(xì)胞發(fā)生自噬，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)研究方面進(jìn)展明顯，已有研究證實(shí)抑郁癥患者尸檢時(shí)海馬區(qū)域自噬標(biāo)志性蛋白Beclin1及LC3表達(dá)升高[19]，另外在藥物導(dǎo)致的長(zhǎng)時(shí)程抑郁細(xì)胞模型組自噬關(guān)鍵蛋白LC3B表達(dá)明顯升高[20]，表明細(xì)胞過(guò)度自噬與抑郁癥的發(fā)生相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠胃竇ICC-MY內(nèi)自噬體增多，自噬蛋白Beclin1及LC3B表達(dá)增多（均p=0.000），提示伴抑郁的FD模型大鼠ICC-MY內(nèi)發(fā)生了過(guò)度自噬。因此筆者推測(cè)，伴抑郁的FD的發(fā)病機(jī)制可能是抑郁引起胃起搏細(xì)胞ICCMY過(guò)度自噬導(dǎo)致其細(xì)胞起搏功能缺失，胃慢波活動(dòng)受阻，胃動(dòng)力下降。

（通訊作者：凌江紅）

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360544；81560763)。

曾麗君（1990-），女，在讀碩士研究生。研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合消化。

凌江紅（1969-），女。博士，教授、主任醫(yī)師。研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合消化。