肉桂水提取物對重型顱腦損傷大鼠腦細胞凋亡、IL-6的影響

董菲菲 潘宇政 彭玲玲 鄧淑蓉 張 慧

廣西醫科大學第一附屬醫院 廣西壯族自治區南寧市 530021

肉桂水提取物對重型顱腦損傷大鼠腦細胞凋亡、IL-6的影響

董菲菲 潘宇政 彭玲玲 鄧淑蓉 張 慧

廣西醫科大學第一附屬醫院 廣西壯族自治區南寧市 530021

目的：通過觀察肉桂水提取物對重型顱腦損傷大鼠腦細胞凋亡、血清白細胞介素(interleukin，IL)-6的影響，探討肉桂對重型顱腦損傷腦組織的保護作用。方法：54只SD大鼠隨機分為三組，根據Feeney′s自由落體打擊造模法復制動物模型。于傷后6h灌胃。灌胃后24h、72h、168h分別通過TUNEL法、ELISA法檢測腦細胞凋亡、血清IL-6的含量。結果：（1）重型顱腦損傷大鼠受傷后血清IL-6明顯升高，持續至168h。用肉桂水提取物干預后，在72h明顯加重血清IL-6的升高，而在168h可以抑制血清IL-6的升高。（2）重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細胞凋亡，這種凋亡一直持續至168h。用肉桂水提取物干預后，在72h明顯加重這種凋亡，而在168h可以改善腦細胞凋亡。其作用與IL-6的含量相關。結論：肉桂水提取物對重型顱腦損傷早期用藥會加劇炎癥反應和細胞凋亡，三天后用藥則呈現明顯的保護作用。

肉桂；重型顱腦損傷；腦細胞凋亡；IL-6

中藥肉桂系樟科植物肉桂的干燥樹皮，性辛、甘、大熱，歸腎、肝、心、脾經，具有補火助陽，散寒止痛，溫通經脈等功能；主要用于陽虛、寒凝瘀滯等病癥的治療[1]。當代有人發現，肉桂水提液對非創傷性缺血性腦損傷具有一定的保護作用[2]，可以通過提高神經因子的表達，從而促進慢性腦缺血后腦組織損傷修復過程[3]。然而這些研究主要是觀察肉桂對缺血性腦損傷的保護作用，對創傷性顱腦損傷的保護作用還未見研究報道。為此，本實驗通過炎癥反應介質IL-6和細胞凋亡等指標，觀察肉桂對重型顱腦損傷腦組織修復的保護作用。

1 實驗材料及儀器

1.1 主要藥品、試劑及儀器

肉桂（產于廣西）購于廣西醫科大學第一附屬醫院中藥房；TUNEL試劑盒購自于Roche公司； ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，編號∶ERC003。改良的Feeney’s 自由落體打擊裝置；Multiskan FC酶標儀（塞默飛世爾儀器有限公司生產）；高速冷凍離心機（英國生產，型號：英泰TDL5M）；正置熒光相差顯微成像鏡（型號：BΧ53+DP73+cellsens）

1.2 實驗動物、動物分組及給藥

SPF級雄性SD大鼠56只，體質量（230±20）g，購自于廣西醫科大學實驗動物中心,許可證號∶SCΧK(桂)2014-0002。SD大鼠隨機分成A組（正常對照組）﹑B組(模型組)﹑C組（肉桂水提取物組）三組，每組各18只。給藥組在造模后6h予肉桂水提取物灌胃，劑量用成人每日常用量5g，換算成大鼠劑量，計算方法依據徐淑云藥理實驗方法學公式計算【劑量=(成人的用量×換算系數0.018×3.16倍)/2】，正常對照組與模型組分別在傷后6h以等量生理鹽水灌胃，各組灌胃均每日1次，連續7天。

1.3 重型顱腦損傷模型制備

根據文獻[4]建立模型。于造模6h后，參照有相關文獻[5]對每只動物行神經功能缺損評分，評分標準參照《現代藥理實驗方法學》[6]，采用10 分制、單盲法進行評分；＞2 分則說明造模成功，＜2 分則剔除。

1.4 標本采集及檢測

1.4.1 標本采集

各組分別在造模后第24、72、168h三個時間段取材，每組每個時間段隨機取6只大鼠。（1）以心臟采血法采血3mL，4℃，2200 r/min離心15min，取上清液，置-80℃冰箱待測IL-6。（2）經升主動脈灌注250mL的0.9%氯化鈉注射液，直至從右心房流出的液體變清亮為止，再灌注4%多聚甲醛液250mL，斷頭取腦，并迅速浸入4%多聚甲醛液中，固定24h后修成4mm塊，常規酒精脫水、石蠟包埋待測腦細胞凋亡。

1.4.2 腦細胞凋亡檢測

以TUNEL原位法檢測損傷區凋亡細胞，嚴格按試劑盒說明步驟進行檢測。每組6只大鼠分別選同一冠狀層的切片在高倍鏡下觀察，細胞核中出現棕黃色的為陽性細胞，8 個高倍視野計數TUNEL陽性標記細胞，計算凋亡陽性細胞百分比，陽性率=陽性細胞數/（陽性細胞數+ 陰性細胞數）×100%。

1.4.3 血清IL-6檢測

采用ELISA法檢測，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行檢測。最后使用酶標儀450nm波長按順序測量各孔的濃度值。

1.5 統計學處理

2 結果

表1：各組血清IL-6含量（±s，pg/ml）

表1：各組血清IL-6含量（±s，pg/ml）

與A組比較，#P＜0.05；與同時間段B組比較，*P＜0.05；與同組168h比較，△P＜0.05

組別N24h72h168h A組1851.03 ±23.7651.02 ±24.3650.03 ±13.76 B組18142.23±52.32#126.53±34.74#102.82±34.50# C組18141.67±6.99#△275.80± 98.67#*△60.09±17.65*

表2：各組腦組織TUNEL細胞凋亡率（±s，%）

表2：各組腦組織TUNEL細胞凋亡率（±s，%）

與A組比較，#P＜0.05；與同時間段B組比較，*P＜0.05；與同組168h比較，△P＜0.05

組別N24h72h168h A組189.44 ± 2.8610.05± 3.1210.25± 2.90 B組1874.75±10.13#68.55±11.46#68.23± 5.46# C組1872.84±6.90#△81.14± 6.86#*△39.74± 12.26#*

2.1 血清IL-6含量

結果見表1。B、C組與A組比較，血清IL-6含量明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。C組在72h與B組比較，C組IL-6含量明顯高于B組。C組在168h與B組比較，C組IL-6含量明顯低于B組。C組在168h時間段與24h、72h兩個時間段比較有差異。B組各時間段比較，無明顯差異（P＞0.05）。這些結果提示，重型顱腦損傷大鼠受傷后外周血血清IL-6明顯升高，一直持續至168h。用肉桂水提取物干預后，在24h無變化，在72h血清IL-6水平明顯升高，而在168h血清IL-6水平明顯下降，接近正常組水平。

2.2 腦組織TUNEL細胞凋亡率

結果見表2。B、C組與A組比較，腦細胞凋亡率明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。C組在72h與B組比較，C組明顯高于B組。C組在168h與B組比較，C組明顯低于B組。C組在168h時間段與24h、72h兩個時間段比較有差異。B組各時間段比較，無明顯差異（P＞0.05）。這些結果提示，重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細胞凋亡，這種凋亡一直持續至168h。用肉桂水提取物干預后，在24h凋亡無變化，在72h凋亡加重，而在168h腦細胞凋亡則比模型組明顯下降。

2.3 血清IL-6水平與腦細胞凋亡的關系

結果見圖1。C 組血清IL-6水平與腦細胞凋亡率相關關系Pearson 的系數r = 0.816，P = 0.000（雙側）。其他各組血清IL-6水平與腦細胞凋亡率無相關關系。結果顯示C組血清IL-6水平與腦細胞凋亡率有正相關關系。

3 討論

重型顱腦損傷早期都存在繼發炎癥反應，這一炎癥反應是導致腦損傷的主要機制之一[7，8]。IL-6 在炎癥反應中扮演著重要角色，Marklund等人[9]認為IL-6在損傷發生后即刻就上升，而且損傷程度越嚴重，血中IL-6的含量就越高，IL-6含量與腦損傷程度呈正比。本研究發現，重型顱腦損傷大鼠受傷后外周血血清IL-6即明顯升高，這一現象一直持續至第168h。結果與Marklund等人的研究結果基本一致。說明顱腦損傷后一周內一直存在明顯的炎癥反應。用肉桂水提取物干預后，在72hIL-6水平比模型組明顯升高，而在168h IL-6水平則明顯降低，接近正常水平。這說明顱腦損傷早期（72h內）用藥，肉桂會加劇顱腦損傷的炎癥反應，從而加重腦組織損傷。而72h后用藥則能夠抑制顱腦損傷的炎癥反應，呈現保護腦細胞的作用。

研究表明，顱腦損傷導致的腦細胞損害除了直接損傷引起的腦細胞死亡外，還存在繼發的細胞凋亡[10-12]。張劍濤[13]等人報道顱腦損傷傷灶周圍額皮質在4h后即開始出現腦細胞凋亡現象，以后凋亡細胞逐漸增加，至3d達高峰，之后有所下降。腦細胞凋亡的原因很多，但顱腦損傷繼發的炎癥反應可能是重要原因之一。實驗中觀察到，重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細胞凋亡，一直持續到168h。用肉桂干預后，腦細胞凋亡在早期明顯加劇，而在72h后明顯減少細胞的凋亡。細胞凋亡的趨勢與炎癥反應重要指標IL-6水平的變化趨勢基本一致。這表明顱腦損傷早期用藥，肉桂會加劇炎癥反應，以致加重腦細胞的凋亡，而72h后用藥則可以抑制炎癥反應，從而減輕腦細胞凋亡，起到保護腦細胞的作用。

肉桂對顱腦損傷炎癥反應和細胞凋亡的影響機制還不是很清楚。可能與肉桂通過抑制炎癥因子降低腦水腫有關。細胞因子炎癥反應可加重腦水腫、腦組織缺氧使得中樞神經系統進一步遭受損害[14]。有人發現肉桂水提物通過減輕缺血區腦組織水腫而明顯降低腦含水量，而對缺血性腦損傷具有一定的保護作用[2]。楊小鋒[15]等人提出，腦組織凋亡細胞數與顱內壓、腦組織含水量在不同時期呈正相關, 在總體的變化過程中也有正相關性。

圖1

（通訊作者：潘宇政）

[1]高學敏.中藥學[M].2版.北京:中國中醫藥出版社,2007:240．

[2]黃宏妙,郭占京,蔣凌風等.肉桂水提液對全腦缺血再灌注損傷大鼠MAO和CAT的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2011(23):159-161.

[3]張文風.肉桂對慢性腦缺血大鼠氧化應激及神經因子表達的影響[J].中醫雜志,2010(07):645-647.

[4]潘宇政,黃李平,李凱等.牛膝對重型顱腦損傷大鼠血清IL-2 及神經細胞凋亡的影響[J].中國中醫急癥,2015,24(02):197-200.

[5]仁增，張躍康，馬潞，等.川芎嗪對大鼠重型顱腦損傷后神經細胞凋亡及Bcl-2、Bax表達的影響[J].中國臨床神經外科雜志,2009,14(01):37-39.

[6]張均田.現代藥理實驗方法[M].北京:北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社,1998:1241.

[7]董為偉.神經保護的基礎與臨床[M].北京:科學出版社,2002:222-238.

[8]趙繼宗,肖新如.顱腦損傷實驗研究的現狀與展望[J].中華實驗外科雜志,2002,19(01):9-10.

[9]Marklund N,Keck C,Hoover R,et al.Administration of monoclonal antibodies neutralizing the inflammatory mediators tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 does not attenuate acute behavioral deficits following experimental traumatic brain injury in the rat[J].Restor Neurol Neurosci,2005,23(01):31-[10] Rink A,Fung KM,Trojanowski JQ,et al.Evidence of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat[J].Am J Pathol,1995,147(06):1575.

[11]Colicos MA，Dash PK.Apoptotic morphology of dentate gyanule cells following experimental cortical impact injury in rats：Possible role in spatial menory deficits[J].Brain Res,1996,739(02):120-131.

[12]Clark RS,Cheng J,Watkins SL,et al.Apoptosis–suppressor gene Bcl -2 expression after traumatic brain injurey in the rats[J].J neurosci,1997,17(06):9172-9182.

[13]張劍濤,王宏磊,徐寧等.大鼠顱腦損傷后神經細胞的凋亡[J].中國生物制品學雜志,2009(09):872-875.

[14]Maier B,Schwerdtfeger K,Mauter A,etal.Differential release of intedeukines-6,8,and 10 incerebrospinal fluid and plasma after traumatic brain injury[J]. Shock,2011:11(05):421-426.

[15]楊小鋒,龔江標,虞軍等.創傷性顱腦損傷后細胞凋亡狀態與腦水腫、顱內壓的相關性研究[J].浙江預防醫學,2005(01):17-19.

國家自然科學基金（NSFC.81460687），廣西壯族自治區衛生廳中醫藥科技專項（GZLC14-29）。

董菲菲（1990-），女，碩士研究生。

潘宇政（1961-），男，碩士生導師。