大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn)L-2-氨基丁酸和D-葡萄糖酸

張蔡喆，楊套偉，周俊平，鄭俊賢，徐美娟，張顯，饒志明

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院, 江蘇 無錫 214122

L-2-氨基丁酸 (L-ABA) 是一種非天然氨基酸，可以作為重要的前體物質(zhì)合成多種手性藥物，包括用于結(jié)核病治療的乙胺丁醇和布瓦西坦，以及抗癲癇藥物左乙拉西坦[1]。目前已開發(fā)出諸多L-ABA的生物合成途徑[2-4]，主要通過脫氫酶或者轉(zhuǎn)氨酶來催化制備，但不對(duì)稱還原反應(yīng)需要等當(dāng)量的輔酶參與，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (即還原型輔酶Ⅰ，NADH)是氧化還原反應(yīng)中重要的輔酶[5]，作為電子供體，1分子NADH可以提供2個(gè)電子用于羰基等基團(tuán)的還原，由于輔酶價(jià)格昂貴，限制了其在工業(yè)水平的應(yīng)用，所以需要另一種底物和酶偶聯(lián)對(duì)輔酶進(jìn)行再生循環(huán)，以解決輔酶限制[6-7]。常用的酶偶聯(lián)法NAD(P)H輔酶循環(huán)體系有兩種[8]。一種是甲酸/FDH再生NADH體系。甲酸脫氫酶 (Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH) 是一種廣泛存在于甲醇利用型的細(xì)菌及酵母中的酶，也是目前還原 NAD+的脫氫酶中國(guó)內(nèi)外研究最多的酶之一[9]。FDH可以使甲酸氧化生成 CO2，同時(shí)將氧化態(tài)的輔酶 NAD+還原為 NADH。另一種是葡萄糖/GDH再生 NAD(P)H體系，葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase，GDH) 是一種氧化還原酶，催化D-葡萄糖得到D-葡萄糖酸，同時(shí)將氧化態(tài)的輔酶NAD+或NADP+還原為NADH或NADPH。在某些情況下，NAD+作為輔酶時(shí)，GDH的酶促效率相比NADPH作為輔酶時(shí)要低[10]。多數(shù)研究采用基因工程技術(shù)對(duì) GDH進(jìn)行克隆和在大腸桿菌中過表達(dá)來解決野生菌中酶活水平不高的問題，實(shí)現(xiàn)氧化還原酶輔酶循環(huán)再生[11]。

例如Galkin等以2-酮丁酸為底物，通過偶聯(lián)亮氨酸脫氫酶 (LDH) 和輔酶 (NADH) 循環(huán)再用酶生甲酸脫氫酶 (FDH)，最終獲得36 g/L的L-ABA，產(chǎn)物得率為88%[12]；……