CRISPR/Cas9介導(dǎo)的高產(chǎn)谷胱甘肽原養(yǎng)型酵母工程菌的構(gòu)建

周文龍，唐亮，成凱，劉忞之，楊燕，王偉

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所 天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

谷胱甘肽 (Glutathione，GSH) 是細(xì)胞內(nèi)含量最多的非蛋白質(zhì)類巰基化合物，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)過(guò)酶催化反應(yīng)合成[1]。GSH因其具有游離的巰基而具有很多生物活性，如抗氧化[2]、脫毒[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]等。體內(nèi)GSH缺失與多種疾病有關(guān)，如夸休可爾癥、癲癇、阿爾茨海默病等[5]。因此，GSH被廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等行業(yè)。目前，GSH在國(guó)內(nèi)主要用于藥物領(lǐng)域，作為肝病和癌癥治療后修復(fù)損傷的輔助用藥，在國(guó)外則以食品添加劑及保健品為主。GSH市場(chǎng)需求逐年增加，有人預(yù)測(cè)至2019年，全球GSH需求量將達(dá)200–300 t[6]。

目前，GSH生產(chǎn)的主要方法是酵母發(fā)酵法。由于野生型釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae和產(chǎn)朊假絲酵母Candida utilis細(xì)胞中 GSH含量高，因此，它們是GSH發(fā)酵生產(chǎn)的重要菌株。提高GSH產(chǎn)量的方法有提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量、提高細(xì)胞生物量[7]、縮短菌株培養(yǎng)周期等。提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量主要通過(guò)遺傳育種完成，目前主要有經(jīng)典篩選 (Classical selection)、遺傳工程育種等方法。提高細(xì)胞生物量主要通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基、優(yōu)化發(fā)酵工藝條件等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)[7]。菌株培養(yǎng)周期則與菌株所處環(huán)境和菌株自身遺傳背景密切相關(guān)。

Murata等分別在1981年和1983年克隆并測(cè)序了編碼GSH生物合成的兩個(gè)酶即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 (GSHⅠ) 和GSH合成酶 (GSHⅡ)的基因gshA和gshB[1]，之后科學(xué)家們又在一些革蘭氏陽(yáng)性菌中發(fā)現(xiàn)了能夠獨(dú)立完成 GSH生物合成的雙功能酶GshF (由gshF編碼)[8-9]。……