CyclinD1及CDK4在軟骨肉瘤診斷中的應用

王克猛 魏世平 牛長磊 王海燕 牛軍強 孟慶聚

·論著·

CyclinD1及CDK4在軟骨肉瘤診斷中的應用

王克猛 魏世平 牛長磊 王海燕 牛軍強 孟慶聚

目的 觀察CyclinD1及CDK4蛋白在軟骨肉瘤中的陽性表達狀態，探討CyclinD1及CDK4蛋白在軟骨肉瘤發生發展中的機制。方法 以SP法檢測腫瘤組織中CyclinD1及CDK4蛋白表達的情況。結果 軟骨肉瘤組織中CyclinD1、CDK4同時高表達，兩者呈正相關關系(P<0.05)。結論CyclinD1及CDK4蛋白均呈高表達，在軟骨肉瘤的發生發展中起互相協同，使腫瘤細胞的生長優勢增強，對腫瘤的發生發展中發揮重要作用。

軟骨肉瘤；CyclinD1蛋白；CDK4蛋白；免疫組織化學

軟骨肉瘤(chondrosarcoma，CHS)起源于軟骨組織的惡性腫瘤，Evans[1]根據軟骨肉瘤的惡性程度分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級。軟骨肉瘤的治療一般是手術局部或廣泛切除，使用放療、化療等輔助治療手段，效果不明顯，手術切除容易發生復發及轉移，預后往往很差[2]。本研究通過免疫組織化學Sp法研究軟骨肉瘤中CyclinD1及CDK4的表達情況，探討其在軟骨肉瘤中表達的臨床意義,進一步研究不同分化程度的軟骨肉瘤細胞增殖、侵襲和轉移之間的變化規律，以期為軟骨肉瘤的分子靶向診斷提供新的標記物。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機選取河北省醫科大學第三醫院病理科、邢臺醫專第一附屬醫院病理科2008年3月至2011年10月手術切除的存檔病例，經病理診斷，明確為軟骨肉瘤。復習原切片及免疫組織化學資料，根據2002年WHO軟組織與骨腫瘤病理學和遺傳學分類標準[3]，經兩位資深骨病理醫師閱片確定，篩選出普通型軟骨肉瘤46例，其中組織學分級Ⅰ級16例、Ⅱ級20例、Ⅲ級10例；患者年齡5～83歲，中位年齡43.7歲；男25例，女21例；發生部位：股骨27例，髖骨(髂骨、恥骨、坐骨)11例，其他部位8例。患者均為散發病例，且為初次手術，術前均未經放療或化療。作為對照另外選取18例骨軟骨瘤及10例正常軟骨組織。

1.2 方法 所有標本均連續切4 μm厚切片，貼于防脫玻片，用Sp法進行免疫組織化學法染色。鼠抗人CyclinD1單克隆抗體、鼠抗人CDK4單克隆抗體試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司，免疫組織化學染色按試劑盒操作說明進行，染色過程中設陽性和陰性對照，陽性對照用已知陽性切片，陰性對照采用PBS代替一抗。

1.3 免疫組化染色結果判斷標準 CyclinD1、CDK4蛋白陽性表達為棕褐色顆粒，主要表達于細胞核內，分布呈現局灶性或彌漫性。顯微鏡下400×高倍鏡下隨機觀察10個視野，每個視野計數100個腫瘤細胞中的陽性細胞數，觀察中向同一方向移動切片，保證觀察切片不重復，不重疊。標本無陽性反應細胞或陽性反應細胞率小于10%為陰性；標本陽性細胞呈淡棕黃色或陽性反應細胞率介于10%～50%為陽性(+)；標本陽性細胞呈深棕黃色，且陽性反應細胞率大于50%為強陽性(++)[4]。

1.4 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CyclinD1蛋白在正常軟骨組織、骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的表達情況CyclinD1蛋白陽性表現為細胞核內有棕黃色顆粒。10例正常軟骨組織中呈弱陽性1例，陰性9例；在5例骨軟骨瘤及28例軟骨肉瘤中CyclinD1呈陽性表達，陽性率分別為27.8%(5/18)、60.9%(28/46)。在骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中CyclinD1的陽性表達率明顯高于正常軟骨組織(P<0.05)，而骨軟骨瘤中CyclinD1的陽性表達率明顯低于軟骨肉瘤(P<0.05)。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ不同組織學分級的軟骨肉瘤中呈陽性表達分別有6、13及9例，陽性率分別為37.5%(6/16)、65%(13/20)和90%(9/10)，陽性表達率與分化程度呈反比(P<0.05)。見圖1,表1、2。

IHC×400IHC×100

圖1 CyclinD1在骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的表達HE

表2 CyclinD1在不同分化程度的軟骨肉瘤中的表達 例

2.2CDK4在正常軟骨組織、骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的表達情況CDK4蛋白陽性表現為細胞核內有棕黃

色顆粒。在正常軟骨組織、骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中CDK4陽性表達率分別為20%(2/10)、38.9%(7/18)、63%(29/46)。在骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中的陽性表達率明顯高于正常軟骨組織(P<0.05)，而軟骨肉瘤中的陽性表達率明顯高于骨軟骨瘤(P<0.05)。CDK4蛋白的陽性表達率在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三級中分別為31.3%(5/16)、75%(15/20)和90%(9/10)，陽性表達率與分化程度呈反比(P<0.05)。見圖2,表3、4。

IHC×400IHC×100

圖2 CDK4在正常軟骨組織及軟骨肉瘤中的表達HE

表4 CDK4在不同分化程度的軟骨肉瘤中的表達 例

2.3CyclinD1與CDK4蛋白的相關性及與軟骨肉瘤主要臨床病理資料間關系CyclinD1及CDK4同時高表達，兩者呈正相關關系(P<0.05)，CyclinD1及CDK4的表達與患者的年齡、性別、腫瘤發生部位及大小差異均無統計學意義(P>0.05)。見表5、6。

表5 CyclinD1和 CDK4的相關性分析 例

表6 CyclinD1、CDK4的表達與臨床病理特征的關系 例

3 討論

細胞周期素(Cyclins)-細胞周期素依賴性激酶(Cyclindependentkinases,CDKs)-細胞周期素依賴性激酶抑制因子(Cyclindependentkinaseinhibitors,CKIs)是調控正常哺乳動物細胞周期的網絡。處于調控中心位置是CDKs，起正調節的是周期素，起負調節作用的是CKIs。在細胞周期中，G1/S期調控點；S期調控點；G2期調控點和中/后期調控點都是非常關鍵的過渡點。尤其G1/S調控點，可以調控細胞周期的時間。細胞周期中的許多因子參與腫瘤細胞的惡性轉化過程中，特別是Gl期相關的各種因子，可單獨或協同促進或抑制惡性腫瘤細胞的發生和發展。

1991年，Motkura等[5]發現了CyclinD1基因，該基因定位于11ql3染色體，其主要功能是與CDK結合并激活之，作為G1期細胞周期素，促使細胞由G1期進入S期。CyclinD1作為蛋白激酶復合體的調節亞基，使損傷的DNA得不到修復。其過度表達可使細胞增殖異常而導致腫瘤形成，因而被認為原癌基因。

CDKs家族是細胞周期調節機制的中心，可以被細胞周期蛋白(Cyclin)作為正性調節因子激活，也可以被細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)抑制，CDKs、Cyclin、CDKI這三種分子的表達和相互作用很大程度上決定了細胞周期的進展程度，主要在G1→S和G2→M兩個轉折點進行自控性調節，而CDKs的活性表達及調控是這種轉變控制裝置的核心。在哺乳動物中已發現的CDKs至少達7種，分別命名為CDC2 (CDK1)、CDK2～7，CDK4蛋白是CDKs蛋白家族中的重要成員，作為細胞周期G1期的調控因子，在細胞惡性轉化的過程中起著至關重要的作用[6,7]，對于細胞的增殖和分化[8]的調節起重要作用。CyclinD1的基因擴增或蛋白過度表達在乳腺癌、卵巢癌、甲狀旁腺癌、胃腸癌、食管癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、口腔癌、肝細胞癌、骨肉瘤等多種人類腫瘤組織中均有報道[9-12]。CDK4蛋白在鼻咽癌、胃癌細胞、腦星形膠質細胞瘤中有明顯擴增或異常表達[13,14]，同時司曉輝等[4]也指出頜骨軟骨肉瘤的發生發展與CDK4的過表達相關。

本實驗中，在正常軟骨組織、骨軟骨瘤及軟骨肉瘤中CyclinD1蛋白的陽性表達率逐步提高，陽性率分別為10%(1/10)、27.8%(5/18)、60.9%(28/46)，軟骨肉瘤與骨軟骨瘤陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，而且CyclinD1蛋白在軟骨肉瘤中的表達隨分化程度的降低其陽性表達明顯增高(P<0.05)。CDK4在軟骨肉瘤中的陽性表達率明顯高于骨軟骨瘤(P<0.05)，而且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ不同組織學分級中的軟骨肉瘤中陽性表達率分別為31.3%(5/16)、75%(15/20)和90%(9/10)，隨分化程度降低而逐漸增高，其陽性表達與組織學分級密切相關(P<0.05)。

綜上所述，當細胞受到外源性增殖分裂信號刺激后，細胞周期因子CyclinD1基因表達增加，CyclinD1蛋白與CDK4蛋白結合、活化，形成以CDK4為催化亞基、CyclinD1為調節亞基的激酶復合體，促使細胞從G1期進入S期，至此細胞的分裂增殖得以完成，這可能是軟骨肉瘤發生、發展的重要因素，是腫瘤細胞增殖的重要機制，可作軟骨肉瘤診斷的分子生物學標志之一，為制訂正確合理的治療方案提供依據，那么我們通過使用CyclinD1及CDK4抑制劑，達到阻止癌細胞增殖的目的，從而為軟骨肉瘤的分子靶向治療提供依據。

1EvansHL,AyalaAG,RomsdahlMM.Prognosticfactorsinchondrosareomaofbone:aclinicopathologicanalysiswithemphasisonhistologicgrading.Cancer,1977,40:818-831.

2Artavanis-TsakonasS,MatsunoK,FortiniME.Notchsignaling.Science,1995,268:225-232.

3LeethanakulC,PatelV,GillespieJ,etal.Distinctpatternofexpressionofdifferentiationandgrowth-relatedgenesinsquamouscellcarcinomasoftheheadandneckrevealedbytheuseoflasercapturemicrodissectionandcDNAarrays.Oncogene,2000,19:3220-3224.

4 司曉輝,金巖,楊連君.細胞周期素依賴激酶4在頜骨軟骨肉瘤的表達及意義.第四軍醫大學學報,2000,21:929-931.

5MotkuraT,BloomT,KimHG,etal.Anovelcyelinencodedbyabell-linkedcandidateoncogene.Nature,1991,350:512.

6MalumbresM,BarbacidM.Cellcycle,CDKsandcanaer:achangingparadigm.NatRevCancer,2009,9:153-166.

7PatelP,AsbachB,ShteynE,etal.Brk/Proteintyrosinekinase6phosphorylatesp27KIPI,regulatingtheactivityofCyclinD-Cyclin-dependentkinase4.MolCellBiol,2015,35:1506-1522.

8DicksonMA.Molecularpathways:CDK4inhibitorsforcancertherapy.ClinCancerRes,2014,20:3379-3383.

9UmekitaY,OhiY,SagaraY,etal.OverexpressionofcyclinD1predictsforpoorprognosisinestrogenreceptor-negativebreastcancerpatients.IntJCancer,2002,8:415-418.

10DworakowskaD,JassemE,JassemJ,etal.PrognosticvalueofcyclinD1overexpressionincorrelationwithpRbandp53statusinnon-smallcelllungcancer(NSCLC).JCancerResClinOncol,2005,31:479-485.

11JooM,KangYK,KimMR,etal.cyclinD1overexpressioninhepatocellularcarcinoma.Liver,2001,21:89-95.

12SiX.Expressionandsignificanceofcellcycle-relatedproteinscyclinD1,CDK4,p27,E2F-1andets-1inchondrosarcomaofthejaws.OralOncol,2001,37:431-436.

13 于洪泉,趙剛,許侃,等.腦星形細胞瘤中CDK4蛋白表達及意義.中國實驗診斷學,2003,7:529-530.

14 趙英芳,田新霞,盧陽.胃癌中p16INK4a-CDK4-pRb通路蛋白表達異常.內蒙古醫學院學報,2005,27:271-274.

Expression and clinical significance of CyclinD1 and CDK4 in chondrosarcoma

WANGKemeng*,WEIShiping,NIUChanglei*,etal.

*DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospitalofXingtaiMedicalCollege,Hebei,Xingtai054000,China

Objective To observe the expression of CyclinD1 and CDK4 proteins in chondrosarcoma,and to explore their action mechanism in pathogebesis and development of chondrosarcoma.Methods The expression levels of CyclinD1 and CDK4 protein were detected by immunohistochemistry (SP).Results The high-expression of CyclinD1 and CDK4 was found in chondrosarcoma tissues,moreover, the expression levels of CyclinD1 were positively correlated to those of CDK4 (P<0.05).Conclusion The high-expressin of CyclinD1 and CDK4 exists in chondrosarcoma tissues,which plays an important role in pathogenesis and development of chondrosarcoma.

chondrosarcoma; cyclinD1 protein; CDK4 protein; immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.07.006

054000 河北省邢臺市，邢臺醫學高等專科學校第一附屬醫院骨科(王克猛、牛長磊、王海燕、牛軍強、孟慶聚)；邢臺醫學高等專科學校(魏世平)

魏世平,054000 河北省邢臺市，邢臺醫學高等專科學校;

E-mail：weishiping2003@163.com

R

A

1002-7386(2017)07-0985-03

2016-07-20)